조혈전구세포(Hematopoietic Progenitor Cells)를 신경 줄기세포(Neural Stem Cells)로 직접 재프로그래밍(Direct Reprogramming of Hematopoietic Progenitor Cells into Neural Stem Cells)

초록

출처: Wang, T., et al. 말초 혈액 조혈전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도. J. Vis. 특급, (2015)

이 비디오는 유전적으로 변형된 조혈전구세포를 신경세포 줄기세포로 직접 재프로그래밍하는 방법을 보여줍니다. 조혈전구세포(hematopoietic progenitor cell)에 의해 발현되는 전사 인자(transcription factor)는 연쇄 반응(cascade of molecular events)을 유발하여 변형을 촉진합니다. 추가 특이적 배지는 유도된 신경 줄기 세포를 선택하고 성장시키는 데 사용됩니다.

프로토콜

1. 신경줄기세포 유도

참고: 세포 상태에 따라 transfection 후 약 5일 또는 7일 후에 단층 부착 세포는 30 - 50% confluence에 도달합니다(그림 1C).

1. 부유 세포와 구체를 포함하는 상층액을 제거한 다음 1ml의 신경전구배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12), 1x N2 보충제, 0.1%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA), 1%(v/v) 항생제, 20ng/ml의 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) 및 20ng/ml의 표피 성장인자(EGF))를 부착 세포에 첨가합니다.
2. 선택적으로, 10분 동안 170 x g에서 세포를 부드럽게 피펫팅하고 원심분리하여 세포 구체를 해리합니다. 상층액을 제거하고 백업으로 명령에 따라 matrigel로 코팅된 새로운 24웰 플레이트에 있는 1ml의 신경 전구 배지에 세포를 재현탁합니다.
3. 세포가 보통 1주일 후에 60 - 80% 합류점에 도달할 때까지, 격일로 매체를 바꾸십시오.
4. 상층액을 버리고 신경줄기세포 배지 1ml(무혈청 배지, NSC SFM)를 추가합니다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 해리한 다음 매우 부드러운 피펫팅을 수행합니다.
5. 세포를 제거하고 모든 세포를 6웰 플레이트의 한 웰에 파종합니다. 신경 줄기 세포 배지 1ml를 더 추가하여 각 웰에 대해 2ml 배지를 만듭니다. 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.
6. 격일로 매체를 변경합니다.
7. 세포가 60% confluence에 도달하면 1.4 및 1.6의 단계에 따라 1:3 비율로 세포를 해리하고 재플레이
팅합니다.

결과

그림 1. 센다이 바이러스 형질주입 후 CD34 세포의 형태학적 변화. (A) 형질주입 시 상당한 수의 CD34 세포가 관찰될 수 있습니다. (B) 구형의 세포 응집체는 센다이 바이러스 형질주입 후 24시간 후에 관찰할 수 있으며, 이는 시간이 지남에 따라 확장됩니다. (C) 대부분, 양극성 부착 세포는 형질주입 5일 후에 나타났습니다. (D 및 E) 신경 줄기 세포의 전형적인 형태는 신경 전구 배지 및 확장 유도 후 표시됩니다. 눈금 막대 : (A) 및 (B)의 경우 200 μm, 다른 사람의 경우 400 μ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
셀 스크레이퍼	사르슈테트	83.183
DMEM/F12	생명 기술	제12400-024	1배
N2 보충제	생명 기술	제17502-048	1배
소 혈청 알부민	시그마	A2934	0.1% (승/v)
bFGF	페프로텍	100-18B	20 ng / ml
증권 시세	페프로텍	AF-100-15
B27 보충제	생명 기술	제17504-044	1배
NSC 세럼 프리 배지	생명 기술	A1050901	1배