신경 줄기세포에서 siRNA 매개 유전자 침묵

초록

출처: Nguyen, B. H., et al. O9-1 신경능선세포의 배양 및 조작. J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오는 신경 줄기 세포에서 관심 있는 특정 유전자를 침묵시키고 적절한 분화 배지를 사용하여 원하는 세포 유형으로 분화하기 위해 작은 간섭 RNA(siRNA)를 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 절차를 통해 신경 줄기 세포의 분화 과정에서 특정 유전자의 중요한 역할을 연구

할 수 있습니다.

프로토콜

1. O9-1 셀의 조작

1. O9-1 세포에서 siRNA knockdown 수행
   1. 실험을 시작하기 전에 24웰 플레이트를 기저 멤브레인 매트릭스로 해동하고 코팅합니다. O9-1 세포를 회수하고 씨를 뿌려 60%에서 80% 농도까지 성장할 수 있도록 합니다.
   2. 적절한 웰 부피에 따라 무혈청 배지에서 리포좀을 희석합니다. 무혈청 배지에서 siRNA를 최종적으로 희석합니다. 희석된 siRNA를 희석된 리포좀에 제조업체에서 권장하는 비율로 첨가합니다. 피펫팅으로 잘 섞은 다음 배양합니다.
      메모: 배양 사용 량, 시간 및 온도에 대한 제조업체의 가이드를 따르십시오.
   3. 제조업체의 권장 사항에 따라 적절한 양의 siRNA-lipid 복합체를 세포에 추가합니다.
   4. 표준 세포 배양 인큐베이터(37 °C, 5% CO₂)에서 24시간 동안 세포를 배양합니다. 적절하게 다운스트림 단계를 수행합니다(RNA 추출, 단백질 추출, 염색 등).
      참고: siRNA knockdown 시간 및 농도는 개별 실험에 따라 달라질 수 있습니다.

2. O9-1 세포 분화

1. O9-1 세포를 조골세포로 분화
   1. 골형성 분화 배지를 준비하기 위해 다음을 알파-MEM(최종 농도 표시)으로 희석합니다: 0.1μM 덱사메타손, 100ng/mL 뼈 형태 유전 단백질 2(BMP2), 50μg/mL 아스코르브산, 10mM b-글리세로포스페이트, 10% FBS, 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신.
   2. 그림 1.
      와 같이 면역염색을 통해 분화된 조골세포에서 조골세포 마커인 osteocalcin을 검출합니다. 참고: 골형성 분화는 조골세포의 다른 마커를 사용하거나 Alizarin red staining 또는 alkaline phosphatase staining을 사용하여 평가할 수도 있습니다.
2. O9-1 세포를 평활근 세포로 분화
   1. 평활근 세포 분화 배지를 준비하려면 DMEM(최종 농도 표시)에서 100U/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신 및 10% FBS를 희석합니다.
   2. 그림 2의 예와 같이 평활근 액틴(SMA)과 같은 평활근 세포 마커에 대한 항체를 사용하여 면역형광 염색을 통한 평활근 세포 분화를 평가합니다.

결과

그림 1: 조골세포 마커 오스테오칼신(Ocn)의 면역형광 염색은 O9-1 세포가 골형성 분화 조건에서 조골세포 세포를 생성했음을 나타냅니다. 세포는 조골세포 마커 Ocn 항체(녹색)로 염색하고, 핵은 DAPI(파란색)로 염색했습니다. 화살표는 Ocn 양성 세포를 나타냅니다. 오스테오칼신(Osteocalcin, Ocn, 파골세포 마커); 다피(',6-디아미디노-2-페닐린돌').

그림 2 : 평활근 액틴(SMA)의 면역형광 염색은 평활...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
O9-1 마우스 두개골 신경능선 세포주	밀리포어 시그마	SCC049
DMEM, 고포도당, 글루타민 무함유	지브코	11960-044
DMEM, 고혈당	하이클론	SH30243.01
FBS(소 태아 혈청)	밀리포어 시그마	ES-009-B
페니실린 - 스트렙토마이신	지브코	15140-122
L-글루타민 200mM (100X)	지브코	제25030-081
HBSS의 트립신-EDTA 0.25%	제네시 사이언티픽	25-510
칼슘 또는 마그네슘이 없는 DPBS(Dulbecco의 인산염 완충 식염수)	론자	17-512층
MEM 비필수 아미노산(MEM NEAA) 100X	지브코	제11140-050
피루브산나트륨 (100mM)	지브코	제11360-070
2-메르캅토에탄올	시그마	엠-7522
재조합 인간 섬유아세포 성장인자-염기성 (rhFGF-basic)	R&D 시스템	제233-FB-025
미토마이신 C	로슈	10107409001
마트리겔 매트릭스	코 닝	356234
DMSO(디메틸설폭사이드)	밀리포어 시그마	MX1458-6
리포펙타민 RNAiMAX	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	13778-075
옵티-MEM I (1X)	지브코	31985-070
최소 필수 매체, Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamine이 함유된 알파 1X	코 닝	10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA	다르마콘	L-041057
ON-TARGETplus 비타겟팅 풀	다르마콘	D-001810
ON-TARGETplus Yap1 siRNA	다르마콘	L-046247
FCS(송아지 태아 혈청)
ITS (인슐린-트랜스페린-셀레늄)
TGF-b3
아스코르브산
BMP2 (뼈 형태 유전 단백질 2)
덱사메타손
B-27 보충제

년 년 년 호 년 호 호 시리즈 ) 년 년