성체 인간 섬유아세포에서 유래한 유도 신경전구세포 군집(Induced Neural Progenitor Cell Colonies)

초록

출처: Meyer, S. et al., Derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into Expandable Neural Progenitor Cells(성인 인간 섬유아세포의 유도 및 확장 가능한 신경전구세포로의 직접 변환).J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오는 성인 인간 섬유아세포에서 유래한 유도 신경전구세포(iNPC)를 분리하는 기술을 보여줍니다. iNPC 군집체를 분리하고 iNPC 개체군의 지속적인 증식 및 확장을 촉진하는 적절한 배양 배지가 있는 상태에서 라미닌 코팅된 다중 웰 플레이트 웰에서 배양하는 데 관련된 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 추정 유도 신경전구세포(iNPC) 콜로니의 격리

1. iNPC 콜로니를 채취하기 하루 전, 48웰 플레이트 1개를 라미닌으로 코팅합니다: Dulbecco의 DPBS(Phosphate-Buffered Saline)에서 라미닌을 1μg/ml로 희석하고, 용액 300μl를 플레이트에 첨가하고, 24시간 동안 4°C를 유지합니다. 하루 뒤, 플레이트에서 라미닌을 흡인하고 200μl의 신경유도 배지(1:1 DMEM/F-12:Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1% GlutaMAX, 10ng/ml 인간 백혈병 억제 인자, 3μM CHIR99021, 2μM SB431542)를 웰에 추가합니다.
2. DPBS로 한 번 채취할 콜로니가 포함된 6개의 웰 플레이트를 세척하고 6개의 웰 플레이트의 웰당 2ml의 신경유도 배지를 추가합니다. 기계적으로 군체를 선택하십시오 : 주변 세포를 제거하기 위해 얇은 바늘을 사용하여 군체 주위를 긁어 내십시오. 200 μL 피펫맨을 50 μL로 설정하고 각 피펫 팁을 사용하여 콜로니를 선택합니다.
3. 각각 하나의 콜로니를 라미닌으로 코팅된 48 웰 플레이트의 한 웰로 옮기고 10회 위아래로 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 기계적으로 생성합니다. ROCK 억제제 Y27632를 최종 농도 10μM로 세포에 첨가합니다.
4. 48 웰 플레이트에서 37 °C, 5 % CO₂에서 2 일 동안 세포를 성장시킵니다. 세포가 80 - 90% 농도에 도달할 때까지 (약 3 - 4일) 2일에 한 번씩 배지를 교체하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CHIR99021	축삭 메드켐	1386
DMEM F12	라이프테크놀러지	제11320-033
디피에스	라이프테크놀러지	제14190-094
글루타맥스	라이프테크놀러지	제35050-038
hLIF	페프로텍	300-05
라미닌	시그마	엘2020
엔2	라이프테크놀러지	제17502-048
뉴로기저	라이프테크놀러지	제21103-049
SB431542	인비보젠	인H-SB43
Y27632	칼바이오켐	CAS 146986-50-7
나27	라이프테크놀러지	제17504-044

년 호 호 호 년 호 호 규격 호