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1. 고밀도 뉴런 배양을 위한 24웰 플레이트 준비
참고: 계획된 배아 적출 전날 다음 단계(2-3)를 수행합니다.
- 2개의 24웰 플레이트를 세포 배양 후드에 넣고 개별 포장을 엽니다.
- 18G 주사기 바늘을 1ml 플라스틱 일회용 주사기에 연결합니다.
- 주사기를 잡고 바늘 끝을 우물 바닥 중앙에서 왼쪽 ~1mm로 조준합니다. 적당한 힘(~250g)을 가하여 웰 바닥(~1mm 길이)을 에칭합니다. 홈이 형성되고 변위된 플라스틱 재료는 평평한 바닥 우물 표면 위에 높은 지지를 형성합니다. 비슷한 방식으로 바닥 중앙의 오른쪽으로 ~1mm 떨어진 곳에 ~1mm 길이의 평행 홈을 더 에칭합니다.
- 두 개의 24웰 플레이트의 모든 웰에 대해 이 단계를 반복합니다. 고밀도 배양에 사용되는 두 개의 24웰 플레이트는 이제 폴리-D-라이신으로 코팅할 준비가 되었습니다(아래 2.8단계 참조).
2. 저밀도 뉴런 배양을 위한 커버슬립 준비
- 직경 12mm # 1 원형 유리를 사용 합니다.
- 직경 50mm의 멸균 플라스틱 페트리 접시에 100개의 커버슬립을 넣고 커버슬립을 20ml 70% 에탄올 용액에 담그십시오. 이 페트리 접시를 한 시간 동안 보통(70rpm) 속도로 회전하는 회전 플랫폼에 놓습니다. 70% 에탄올을 제거한 다음 70% 에탄올의 새 배치로 교체하십시오. 한 시간 더 돌려서 세탁합니다.
- 70% 에탄올 세척액을 버리십시오. 멸균수(0.2μm 필터 장치를 통해 여과)를 추가합니다. 페트리 접시를 손으로 돌려 커버슬립을 단단히 헹굽니다. 세 번 헹구고 매번 신선한 멸균수로 교체하십시오.
- 커버슬립이 있는 페트리 접시를 층류가 있는 멸균 세포 배양 후드 안에 넣습니다. 진공 라인을 통해 헹굼수를 흡입하고 여과된 멸균수 10ml를 추가하여 커버슬립을 담그십시오. 커버슬립은 멸균되어야 하며 표면은 폴리-D-라이신 코팅을 할 수 있을 만큼 충분히 깨끗해야 합니다.
- 개별 포장에서 2개의 24웰 플레이트를 열고 후드에 넣습니다.
- 후드의 진공 라인을 켭니다. 200 μl 피펫 팁을 진공 라인에 연결하고 가위를 사용하여 팁을 절단하여 더 큰 구멍을 만듭니다.
- 가는 팁 #5 핀셋을 사용하여 페트리 접시에서 커버슬립을 한 번에 하나씩 집고 진공 라인을 사용하여 커버슬립을 완전히 건조시킵니다. 그런 다음 24웰 플레이트의 각 웰에 하나의 커버슬립을 놓습니다. 청소된 50개의 커버슬립은 두 개의 24웰 플레이트의 각 웰을 채우기에 충분해야 합니다.
- 폴리-D-라이신 원액(1mg/ml)을 붕산염 완충액(pH 8.5)이 있는 작업 용액(0.1mg/ml)으로 희석합니다. 4개의 24웰 플레이트(바닥이 에칭된 고밀도 플레이트 2개 포함)의 경우 총 작업 용액 30ml를 준비합니다.
- 유리 커버슬립이 있는 각 웰에 300μl, 0.1mg/ml 폴리-D-라이신 작업 용액을 추가합니다. 커버슬립이 용액에 완전히 잠겼는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 #5 핀셋 팁을 사용하여 커버 슬립을 웰 바닥에 대고 누르고 팁을 사용하여 폴리 D-라이신 용액을 가이드하여 커버 슬립의 모든 표면을 덮습니다. 모든 커버슬립을 육안으로 검사하여 플레이트와 커버슬립 사이에 공기가 끼지 않았는지 확인합니다.
- 바닥이 에칭된 고밀도 배양 플레이트의 각 웰에 300μl 0.1mg/ml 폴리-D-라이신 작업 용액을 추가합니다. 손으로 회전하여 용액을 펴서 우물 바닥 전체를 덮습니다.
- poly-D-lysine이 포함된 4개의 플레이트를 모두 배양 인큐베이터에 다시 넣고 O/N을 배양합니다.
3. 배양을 위한 세척 및 사전 컨디셔닝 플레이트
참고: 다음 단계(3-5)는 조직 채취 당일에 수행됩니다.
- 커버슬립 및 24웰 플레이트 O/N의 배양/코팅 후 4개의 플레이트(도너 커버슬립이 있는 2개, 에칭된 플라스틱 바닥이 있는 수용체 고밀도 플레이트 2개)를 모두 배양 후드로 가져옵니다. 진공 라인을 사용하여 poly-D-lysine 용액을 제거합니다.
- poly-D-lysine 용액을 제거한 직후 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 각 웰에 ~1ml의 멸균수를 추가합니다. 모든 우물에 물이 채워지면 10분 동안 그대로 두십시오. 진공으로 물을 제거한 다음 각 웰에 300μl 세척 매체를 추가하여 웰 바닥을 덮습니다(유리 커버 슬립 유무에 관계없이). 폴리-D-라이신 코팅이 마르지 않도록 하십시오.
- 플레이트 4개를 모두 cell incubator에 다시 넣습니다. 플레이트는 분산된 해마 뉴런이 준비되면 사용할 준비가 됩니다.
4. 뉴런의 도금과 장기적인 공동 배양
- 고밀도 뉴런을 위해 바닥이 에칭된 2개의 24웰 플레이트를 세포 배양 후드로 가져옵니다. 300μl의 전처리 매체를 진공으로 제거합니다. 플레이트 0.6ml 고밀도 세포 현탁액, 250,000 neurons/ml.
- 커버슬립이 있는 다른 2개의 24웰 플레이트를 배양 후드로 가져오고 진공으로 300μl 전처리 배지를 제거합니다. 플레이트 0.6ml 저밀도 세포 현탁액은 10,000 뉴런/ml에서 두 개의 24웰 플레이트 내부의 커버슬립입니다.
- 4개의 24웰 플레이트를 모두 인큐베이터에 다시 넣습니다. 2시간 동안 그대로 두십시오.
- 고밀도 배양에 뉴런이 부착된 저밀도 커버슬립을 뒤집습니다. 뉴런이 서로 마주보고 있는지 확인하십시오(즉, 유리 커버슬립으로 분리되지 않음). 그런 다음 공동 배양이 있는 두 개의 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
5. 공동 문화 유지
- 시험관 내(DIV)에 300μl의 신선한 사료 배지(재료 참조)를 첨가하여 공동 배양을 공급합니다 5. 다른 많은 연구에서 보고된 바와 같이 원래의 완전한 배양 배지의 50%를 제거할 필요는 없습니다. 공급 매체에는 또한 15μM 시토신 아라비노사이드(Ara-C, 최종 농도 5μM)가 포함되어 있어 신경교세포 오염 및 증식 가능성을 최소화합니다.
- 이 초기 공급 후 매주 Ara-C가 없는 300μl의 신선 사료 배지를 웰에 추가합니다. 배양액을 1개월 이상 보관하는 경우, 1개월 시점을 넘어 매주 배지의 절반을 신선한 사료 배지로 교체합니다(DIV33에서 첫 번째 배지 절반 교체). 형태학적으로, 고밀도 뉴런과 저밀도 뉴런 모두 최대 3개월(실험자들이 관찰한 가장 긴 시간)까지 건강해 보입니다.