인간 신경모세포종 세포주를 성숙한 뉴런으로 분화

초록

출처: Shipley, M. M., et al. SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포주의 분화. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 체계적인 파시징 기술을 사용하여 미분화 SH-SY5Y 신경모세포종 세포를 완전히 분화된 성숙한 뉴런으로 변환하는 기술을 보여줍니다. 여기에는 혈청 수치가 점진적으로 감소하는 일련의 배지에서 세포를 배양하여 상피와 같은 세포의 증식을 억제하는 동시에 뉴런과 같은 세포의 분화 및 증식을 촉진하는 것이 포함됩니다. 또한, 배지에는 레티노산과 특정 성장 인자로 보충되어 뉴런과 같은 세포의 말단 분화를 유도하여 광범위한 분지 형태를 나타내는 성숙한 뉴런으로

유도합니다.

프로토콜

1. 일반적인 고려 사항

1. 필요한 시약 목록은 재료/장비 표를 참조하십시오. 엄격한 무균 조건에서 모든 단계를 수행합니다.
2. FBS를 포함하는 모든 배지 제제에 열 불활성화 소 태아 혈청(hiFBS)을 사용합니다. 열을 비활성화하려면 FBS 분취액 50ml를 56°C에서 10분마다 뒤집어 30분 동안 가열합니다(표 1 참조).
   메모: 열 불활성화 없이 FBS를 사용하면 SH-SY5Y 세포 배양 과정에서 상피와 같은 표현형이 더 빠르게 진행됩니다.
3. 사용하기 전에 배지를 인큐베이터에서 예열 및 평형을 유지하여 모든 단계 전에 적절한 pH 균형을 설정하십시오. 예를 들어, 50ml의 매체는 완전히 평형을 이루는 데 약 1시간이 걸립니다(pH 7, 37°C, 5% CO₂).
   메모: 이 프로토콜은 부분적으로 분화된 SH-SY5Y 세포를 트립신화하고 다시 플레이팅해야 하는 2단계 분할 절차를 사용합니다. 이것은 매우 연약한 세포에 스트레스가 많은 과정입니다. 따라서 최소한의 시간 동안 트립신에서 세포를 배양하는 것이 중요합니다. 이것은 뉴런의 우선적인 상승을 허용하여 상피와 같은 세포가 접시에 여전히 붙어 있도록 합니다.
4. 세포가 들어 있는 원뿔형 튜브의 바닥에 끝이 닿도록 10ml 플라스틱 피펫을 사용하여 분화된 세포의 분쇄를 천천히 수행합니다. 느린 속도로 트리처레이션을 5회 이상 위아래로 수행하지 마십시오.
   

2. 미분화 SH-SY5Y 신경모세포종 세포의 해동 및 배양

1. 기본 성장 매체를 준비합니다.
2. 37°C 수조에서 얼어붙은 세포를 빠르게 해동합니다(약 2분).
3. 15ml 원뿔형 튜브에 9ml Basic Growth Media에 세포를 재현탁시킨 다음 1,000 x g에서 2분 동안 원심분리합니다.
4. 펠렛화된 세포를 방해하지 않도록 주의하면서 상층액을 흡인하고 10ml Basic Growth Media에서 세포를 부드럽게 재현탁합니다.
5. T-25 플라스크 또는 60mm² 접시에 셀을 플레이트합니다.
6. 다음 날, 배지를 교체하여 죽은 세포를 제거합니다.

3. 0일차: 분화를 위한 세포 도금

1. 차별화 일정은 그림 1을 참조하십시오.
2. 미분화 세포를 1x PBS로 헹구고 흡인시킨 다음 1-2ml의 가온 1x 0.05% 트립신-EDTA를 사용하여 트립신화합니다.
3. 세포가 트립신에 있을 때, 인큐베이터에서 약 3분 동안 배양합니다.
4. 10ml의 기초 성장 배지를 첨가하여 트립신을 담금질하고 플라스크 또는 접시의 측면을 헹구고 1-3회 부드럽게 분쇄합니다. 내용물을 15ml 원뿔형 튜브에 옮깁니다.
5. 1,000 x g에서 2분 동안 원심분리기를 하고 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 매체를 흡입합니다.
6. 펠릿을 5ml 염기성 성장 배지에 재현탁시키고 1-3회 분쇄합니다.
7. 혈구계를 사용하여 세포를 계수한 다음 Basic Growth Media를 사용하여 50,000 cells/ml로 희석합니다.
8. 35mm 접시²개당 세포 2ml를 접시당 총 100,000개의 세포로 플레이트하고 인큐베이터에 다시 넣습니다.

4. 1일차: 미디어 변경 (차별화 미디어 #1)

1. 분화 매체 #1(표 2 참조) 50ml를 분주하고 37°C 수조에서 배양합니다.
2. 매체가 가열되면 인큐베이터(37°C, 5% CO₂)에서 최소 1시간 동안 평형을 유지하여 사용하기 전에 적절한 pH 균형을 설정하십시오.
3. 접시에 배지를 추가하기 직전에 예열 및 평형 배지에 레티노산(RA)(표 1 참조)을 추가합니다.
   메모: 레티노산은 빛에 민감하므로 4°C의 어두운 병에 보관해야 합니다.
4. 오래된 미디어를 부드럽게 흡인하여 버리십시오.
5. 35mm² 접시당 RA가 포함된 2ml 분화 배지 #1을 추가하고 인큐베이터로 다시 넣습니다.

5. 3일차: 미디어 변경 (차별화 미디어 #1)

1. 섹션 4 반복(1-5단계)

6. 5일차: 미디어 변경 (차별화 미디어 #1)

1. 섹션 4 반복(1-5단계)

>7. 7일차: 셀 나누기 1:1

1. 접시에 배지를 추가하기 직전에 가열되고 평형화된 분화 배지 #1에 RA를 첨가합니다.
2. 오래된 미디어를 부드럽게 흡인하여 버리십시오.
3. 35mm² 접시당 200μl를 가열한 0.05% 1x 트립신 EDTA를 추가하고 인큐베이터에서 약 2-3분 동안 또는 현미경으로 관찰한 바와 같이 세포가 플레이트에서 눈에 띄게 들어 올려질 때까지 가열합니다.
4. 35mm² 접시당 RA가 포함된 2ml 분화 배지 #1을 추가하여 트립신을 담금질하고 배지를 사용하여 플레이트에서 나머지 신경 세포를 헹굽니다. 그런 다음 내용물을 50ml 원추형 튜브에 옮깁니다.
   메모: 트립신화 단계에서 한 번에 너무 많은 요리를 트립신화하지 마십시오. 이는 세포독성을 유발할 수 있는 트립신에서 뉴런 배양이 너무 오래 배양되지 않도록 하는 데 도움이 됩니다.
5. 50ml 원뿔형 튜브에 최대 10개 접시의 내용물을 결합하고 10ml 플라스틱 피펫으로 5회 이상 위아래로 천천히 분쇄합니다.
6. 2ml 세포 현탁액을 신선한 35mm² 접시에 나누고 인큐베이터로 돌아갑니다.

8. 8일차: 미디어 변경 (차별화 미디어 #2)

1. 접시에 배지를 추가하기 직전에 예열 및 평형 미디어에 RA(표 1 참조)를 추가합니다.
2. 오래된 미디어를 부드럽게 흡인하여 버리십시오.
3. 35mm²접시당 RA와 함께 2mL 분화 매체 #2(표 2 참조)를 천천히 추가하고 인큐베이터로 돌아갑니다. 뉴런은 빨리 건조될 수 있으므로 장기간 공기에 노출되지 않도록 하십시오.

9. 9일차: ECM(Extracellular Matrix) 코팅 접시 준비

1. ECM 용액 한 바이알을 얼음에 넣고 1:100으로 희석하여 차가운 DMEM으로 만듭니다.
2. 각 35mm² 접시에 혼합물 2ml를 분배하고 접시의 전체 바닥이 덮여 있는지 확인합니다.
3. 인큐베이터(37°C, 5% CO₂)에 1시간 또는 하룻밤 동안 넣습니다.
4. 혼합물을 흡입하고 후드에서 약 1시간 동안 자연 건조시킵니다. 실온에서 최대 2개월까지 보관하세요.

10. Day 10: ECM 코팅 플레이트에 세포 전달 1:1

1. 접시에 배지를 추가하기 직전에 예열 및 평형 미디어에 RA(표 1 참조)를 추가합니다.
2. 미디어를 부드럽게 흡입하여 버리십시오.
3. 각 35mm² 접시에 200μl의 따뜻한 트립신을 추가하고 약 1-2분 동안 또는 현미경으로 관찰한 대로 접시에서 뉴런이 눈에 띄게 들어 올려질 때까지 실온에서 배양합니다.
   메모: 트립신으로 뉴런을 과도하게 배양하여 손상을 일으키지 않도록 실온에서 이 트립신화 단계를 실행합니다. 이 단계에서 뉴런은 상피와 같은 세포보다 훨씬 빠르게 판에서 방출됩니다.
4. 35mm² 접시당 2ml 분화 배지 #2를 추가하여 트립신을 담금질하고 배지를 사용하여 플레이트에 남아 있는 신경 세포를 헹굽니다. 그런 다음 내용물을 50ml 원뿔형 튜브에 옮깁니다.
5. 50ml 원뿔형 튜브에 최대 10개 접시의 내용물을 결합하고 10ml 플라스틱 피펫으로 5회 이상 위아래로 천천히 분쇄합니다.
6. 2ml 세포 현탁액을 ECM 코팅된 35mm² 접시에 분배하고 인큐베이터로 다시 넣습니다.

11. 11일차: 미디어 변경 (차별화 미디어 #3)

1. 접시에 배지를 추가하기 직전에 예열 및 평형 미디어에 RA(표 1 참조)를 추가합니다.
2. 오래된 미디어를 부드럽게 흡인하여 버리십시오.
3. 35mm²접시당 RA가 있는 2ml 분화 매체 #3(표 2 참조)을 천천히 추가하고 인큐베이터로 반환합니다. 뉴런이 장기간 공기에 노출되지 않도록 하십시오.

12. 14일차: 미디어 변경 (차별화 미디어 #3)

1. 섹션 11(1-3단계)을 반복합니다.

13. 17일차: 마지막 미디어 변경 (차별화 미디어 #3)

1. 섹션 11(1-3단계)을 반복합니다.

14. 18일차: 사용할 준비가 된 신경 배양

1. 뉴런 건강을 유지하기 위해 3일마다 RA가 있는 새로운 분화 배지 #3으로 배지를 교체하십시오.
   메모: 세포는 뉴런으로 분화되어야 하며 뉴런 표현형을 나타내야 합니다. 배양은 일반적으로 말단 분화 후 최대 14일 동안 안정적입니다. 그러나 뉴런 생존 기간(survival of nucleon)의 지속 기간은 분화가 시작될 때 미분화된 세포의 통과 수에 따라 달라집니다. 계대 수가 높을수록 유효 수명이 더 짧은 차별화된 뉴런이 생성됩니다.

표 1: 재고 솔루션 및 구성 요소.

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구성 요소	세부 정보	주식	지시
10μM RA	올 트랜스 레티노산	5 밀리미터미터	33.3ml 95% EtOH에 50mg RA를 재현탁합니다. RA는 열, 빛 및 공기에 민감합니다. 어두운 병에 보관하고 4 °C에서 최대 6 주 동안 보관하십시오. 1:500 희석에서 사용하고 사용 직전에 분화 매체로 희석
(300.44g/몰)
B-27 1대	B-27 보충제	50배	1-10ml 병과 나머지 분취액을 일회용 1ml 분취액으로 해동하고 -80°C에서 보관합니다.10ml 병을 -20°C에서 보관하십시오
20 mM KCl	염화칼륨	1 M	18.6g KCl과 멸균 필터에 250ml의 물을 추가합니다. 실온에서 보관
(74.55g/몰)
2 mM db-cAMP	디부티릴 사이클릭 AMP	1 M	1gdb-cAMP에 2.04ml의 물을 추가하여 전체 병을 다시 현탁합니다. 빛과 습기에 민감합니다. -20 °C 또는 -80 °C에서 100 μl 또는 200 μl의 부분 표본으로 보관
(491.37g/몰)
50 ng/ml BDNF	뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF)	-	분말을 바닥에 떨어뜨리기 위한 원심분리기 바이알. 10μg 바이알을 1ml Neurobasal + 1x B27 또는 5μg 바이알을 0.5ml Neurobasal + 1x B27에 재현탁하여 10μg/ml를 얻습니다. 1:200 희석에서 사용합니다. 작동 부분 표본을 -80 °C에서 보관 (예 : 250 μl)
안녕FBS	열 비활성화 소 태아 세럼	-	부분 표본은 FBS를 50ml 원뿔형 튜브로 해동했습니다. 56°C의 수조에서 30분 동안 가열합니다. -20 °C에서 작동 부분 표본을 제거하고 동결

표 2: 미디어 레시피.

. . .

기본 성장 미디어
구성 요소	500ml의 용량	희석
에밈	415ml EMEM
15% 높은 FBS	75ml hiFBS
1x 펜/스트렙	5ml 펜/스트렙	1:100
2mM 글루타민	글루타민 5 ml	1:100
*최대 6주 동안 유지
차별화 미디어 #1
구성 요소	50ml의 용량	희석
에밈	48 ml EMEM
2.5% 높은 FBS	1.3ml hiFBS
1x 펜/스트렙	500μl 펜/스트렙	1:100
2mM 글루타민	500 μl 글루타민	1:100
10μM RA	100μl RA(5mM 재고)	1:500h
*최대 2주 동안 보관하고 사용 직전에 RA를 추가하십시오
*RA가 추가되면 추가 미디어를 보관하지 마십시오 - RA가 불안정합니다.
차별화 미디어 #2
구성 요소	50ml의 용량	희석
에밈	49 ml EMEM
1% 하이FBS	500μl hiFBS
1x 펜/스트렙	500μl 펜/스트렙	1:100
2mM 글루타민	500 μl 글루타민	1:100
10μM RA	100μl RA(5mM 재고)	1:500h
*최대 2주 동안 보관하고 사용 직전에 RA를 추가하십시오
*RA가 추가되면 추가 미디어를 보관하지 마십시오 - RA가 불안정합니다.
차별화 미디어 #3
구성 요소	50ml의 용량	희석
뉴로기저	47 ml 뉴로베이스알
B-27 1대	1ml B-27(50X 재고)	오전 1:50
20 mM KCl	1ml KCl(1M 재고)	오전 1:50
1x 펜/스트렙	500μl 펜/스트렙	1:100
2mM 글루타맥스I	500μl 글루타맥스I(100x 스톡)	1:100
50 ng/ml BDNF	250μl BDNF 재고(10μg/ml)	1:200
2mM 디부티릴 사이클릭 AMP(db-cAMP)	100μl db-cAMP(1M 재고)	1:500h
10μM RA	100μl RA(5mM 재고)	1:500h
*최대 2주 동안 보관하고 사용 직전에 RA를 추가하십시오
*RA가 추가되면 추가 미디어를 보관하지 마십시오 - RA가 불안정합니다.

결과

그림 1: 차별화 절차의 시간표. 차별화 프로세스는 18일 동안 11단계로 구성됩니다. 분화 프로토콜의 첫날(day 0)에 25,000개에서 100,000개 사이의 세포가 코팅되지 않은 35mm 접시에 도금됩니다. 1일, 3일, 5일째에는 오래된 미디어가 제거되고 차별화 미디어 #1이 적용됩니다. 7일차에는 Differentiation Media #1에서 코팅되지 않은 35mm 접시에 세포를 1:1로 분할합니다. 8일째에는 배지를 Differentiation Media #2로 변경하고, 10일째에는 세포를 다시 1:1로 분할하지만, 이번에는 Differentiation Media #2에서 ECM 코팅된 35mm 접시로 분할합니다. 11일, 14일, 17일에는 오래된 미디어가 제거되고 차별화 미디어 #3이 적용됩니다. 1...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
나-27	써모피셔 사이언티픽	제17504-044	준비는 표 1을 참조하십시오
뇌 유래 신경 영양 인자(Brain-derived Neurotrophic Factor, BDNF)	시그마	SRP3014(10μg)/B3795(5μg)	준비는 표 1을 참조하십시오
디부티릴 사이클릭 AMP(db-cAMP)	시그마	D0627	준비는 표 1을 참조하십시오
디엠소	증권 시세	4-엑스	-
최소 필수 매체 독수리(EMEM)	시그마	M5650	-
소 태아 세럼(FBS)	하이클론	SH30071.03	준비는 표 1을 참조하십시오
글루타맥스I	생명 기술	제35050-061	-
글루타민	하이클론	SH30034.01	-
염화칼륨(KCl)	피셔 사이언티픽	BP366-1	준비는 표 1을 참조하십시오
MaxGel ECM(Extracellular Matrix) 솔루션	시그마	0282회	프로토콜의 11단계를 참조하십시오.
뉴로기저	생명 기술	제21103-049	-
페니실린/스트렙토마이신(Pen/Strep)	생명 기술	15140-122	-
레티노산(RA)	시그마	R2625	이 시약은 빛에 민감하므로 4 °C의 어두운 곳에 보관해야 합니다.
SH-SY5Y 셀	증권 시세	CRL-2266	-
0.5% 트립신 + EDTA	생명 기술	제15400-054	-
팔콘 35mm TC 접시	Falcon (코닝 브랜드)	353001	-

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