마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전구 세포를 생성하는 기술

초록

출처: Mao, X., et al. Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro(생쥐 배아 줄기 세포의 신경 세포 분화) In vitro. J. Vis. 특급 (2020).

이 동영상은 마우스 배아 줄기 세포(mESC)에서 신경전구세포(NPC)를 체외에서 생성하는 방법을 보여줍니다. mESC는 현탁액에서 배양되어 배아체(EB)를 형성한 다음, 부착 배양에서 레티노산 처리를 통해 NPC로 분화하도록 유도됩니다.

프로토콜

1. 마우스 배아 줄기 세포 배양

1. 0.1% 젤라틴으로 코팅된 세포 배양 접시 또는 플레이트를 준비합니다.
   1. 멸균된 0.1% 젤라틴 2mL(물 중 0.1% w/v)를 60mm 세포 배양 접시에 추가합니다. 세포 배양 접시의 균일한 코팅을 보장하기 위해 부드럽게 흔듭니다.
   2. 접시를 37°C의 5% CO₂ 인큐베이터에 넣고 1시간 동안 코팅합니다.
   3. 세포를 씨를 뿌리기 전에 0.1% 젤라틴 해결책을 제거하십시오.
      메모: 젤라틴을 제거한 후에는 코팅된 접시를 건조시키거나 씻을 필요가 없습니다.
2. 마우스 배아 줄기세포(A2lox 및 129) 배양
   1. 5% CO₂ 인큐베이터에서 각각 37°C의 mESC 성장 배지에서 0.1% 젤라틴으로 코팅된 60mm 세포 배양 접시에서 mESC(A2lox 및 129) 세포를 배양합니다. mESC 성장 배지는 85% 녹아웃 둘베코의 변형 이글 배지/영양 혼합물 F-12(DMEM/F12), 15% 녹아웃 혈청 대체(KSR), 0.1mM β-메르캅토에탄올(2ME), 2mM 글루타맥스, 1% 비필수 아미노산(NEAA), 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S), 1000 U/mL 백혈병 억제 인자(LIF), 10 nM CHIR-99021(GSK-3 억제제) 및 0.33 nM PD0325901(MEK 억제제)으로 구성됩니다.
      주의: β-메르캅토에탄올은 가연성이며 흡입 독성이 있습니다. 화기로부터 멀리 유지하고 사용 시 흡입을 방지하기 위해 마스크를 착용하십시오.
   2. A2lox 및 129의 더 나은 성장을 위해 mESC 성장 매체를 매일 변경합니다.
   3. 세포가 80% confluence에 도달하면 배지를 제거하고 1mL의 0.1% 트립신을 접시에 추가합니다. 모든 세포에서 트립신이 고르게 덮이도록 30초 동안 부드럽게 흔듭니다.
   4. 트립신화가 진행될 때까지 세포를 약 1분 동안 그대로 두었다가 1mL 피펫을 사용하여 트립신을 제거합니다.
   5. 2mL의 mESC 성장 배지를 접시에 넣고 피펫을 위아래로 여러 번 넣어 단일 세포 현탁액을 만듭니다.
   6. 혈구계를 사용하여 현탁액에 있는 세포의 밀도를 가능한 한 정확하게 계수합니다.
   7. 세포를 7개의 그룹으로 나누고 표 1에 표시된 다른 프로토콜을 사용하여 분화를 유도합니다.

2. mESC에서 NPC로의 차별화

1. 0.1% 젤라틴 코팅된 세포 배양 플레이트 또는 커버슬립을 준비합니다.
   1. 사용하기 전에 1.1단계와 같이 0.1% 젤라틴 코팅된 6웰 플레이트 또는 커버슬립을 준비합니다.
2. 차별화(표 1)
   1. 1.5 x 10⁶ mESC를 10 mL의 기초 분화 배지 I에 있는 비접착 박테리아 접시에 첨가하여 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C의 배아체 형성을 허용합니다.
   2. 2일 후, 세포 응집체를 15mL 원심분리 튜브로 옮기고 중력에 의해 침전되도록 합니다.
   3. 상층액을 제거하고 10mL의 새로운 기저 분화 배지 I을 첨가하여 배아체를 재현탁합니다. 새로운 비접착성 박테리아 접시에 다시 심고 2일 더 구별하십시오.
   4. 현미경으로 배아체의 형성을 확인합니다(그림 1A).
   5. 2.2.2-2.2.3 단계에 설명된 대로 배아체를 수집합니다. 웰당 2mL의 기저 분화 배지 I에 약 50개의 배아체를 0.1% 젤라틴으로 코팅된 6웰 플레이트에 파종합니다.
   6. 1mM 올 트랜스 레티노산(RA) 스톡(DMSO)을 준비하고 하위 포장 후 빛을 피해 -80°C 냉동고에 보관합니다.
      메모: RA는 불안정하므로 RA 스톡을 준비하는 동안 빛을 피하고 공기 접촉을 줄이는 데 주의를 기울여야 합니다.
   7. RA 유도의 경우 각 웰에 2μL의 RA 스톡을 추가하여 최종 농도를 1μM로 만듭니다.
   8. 플레이트를 37°C의 5% CO₂ 인큐베이터에 넣고 4일 더 구별합니다.
   9. 2일마다 전체 2mL의 기저 분화 배지 I(1μM RA 포함)을 교체합니다.

표 1: 차별화에 사용된 프로토콜의 세부 정보.

프로토콜	미디어
4일 배아체 형성 + 4일 RA 유도	기초 분화 매체 : DMEM/F12 +15%FBS + 1%NEAA+0.1mM 2ME+ 1%P/S

결과

그림 1: 배아체의 형태.(A) 4일 동안 배양된 배아체. (B) 2일 동안 배양된 배아체.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
B-27 보충제 (50X), 무혈청	지브코	17504044	-20 °C에 저장하고, 빛에서 보호하십시오
CHIR-99021 (CT99021)	셀렉	S1263 (영어	-20°C에서 보관
커버슬립	둥지	801007
소 태아 세럼	하이클론	SH30084.03	-20 °C에서 보관하고 동결 및 해동을 반복하지 마십시오.
젤라틴	지브코	CM0635B	실온에서 보관
글루타맥스 보충제	지브코	35050061	4 °C에서 보관
녹아웃 DMEM/F-12	지브코	12660012	4 °C에서 보관
KnockOut 세럼 교체	지브코	10828028	-20 °C에서 보관하고 동결 및 해동을 반복하지 마십시오.
MEM 비필수 아미노산 용액	지브코	11140076	4 °C에서 보관
N-2 보충제 (100X)	지브코	17502048	-20 °C에 보관하고 빛으로부터 보호하십시오
Neurobasal 배지	지브코	21103049	4 °C에서 보관
인산염 완충 식염수(1X)	하이클론	SH30256.01ᄂ	4 °C에서 보관
페니실린/스트렙토마이신 용액	하이클론	SV30010	4 °C에서 보관
PD0325901(미르다메티닙)	셀렉	S1036 (영어	-20°C에서 보관
레티노산	시그마	R2625	-80 °C에 보관하고 빛으로부터 보호하십시오
Strain 129 마우스 배아 줄기 세포	시아겐	무아에스-01001	피더가 없는 배양 시스템으로 유지
트립신 0.25%(1X) 용액	하이클론	SH30042.01	4 °C에서 보관
2-메르캅토에탄올	지브코	21985023	4 °C에 보관하고 빛으로부터 보호하십시오
60mm 세포 배양 접시	코 닝	430166
15ml 원심분리기 튜브	증권 시세	339650