감각신경절(Sensory Ganglia)로부터 세포의 격리(Isolation of Cells from Sensory Ganglia)

초록

출처: Kaelberer, M. M., et al. 생쥐에서 기도 신경 신경 감각 뉴런을 표적으로 하고 격리하는 방법. J. Vis. 특급. (2016).

이 비디오는 쥐의 감각 신경절에서 세포를 분리하는 것을 보여줍니다. 신경절은 세포외 기질을 용해시키기 위해 효소 분해를 받습니다. 그런 다음 세포 스트레이너를 통한 필터링을 통해 단일 세포를 수집한 다음 잔해물 제거를 위한 밀도 구배 원심분리를 수행합니다. 마지막으로, 향후 분석을 위해 분리된 세포를 수집하기 위해 세척 및 원심분리가 수행됩니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 감각 신경절 해리

1. 500μl Ganglia Dissociation Solution(GaDS)을 피펫으로 빼내고(표 1), 튜브에 신경절을 남깁니다. 1ml의 인산염 완충 용액(PBS)을 첨가하여 신경절을 한 번 세척하고 신경절이 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 기다린 다음 PBS를 피펫으로 빼냅니다.
2. 각 튜브에 GaDS 1ml와 소화 효소 22μl(콜라겐분해효소 I/II 및 프로테아제 혼합물, 물 중 2.5mg/ml)를 추가합니다.
3. 포지티브 대조 튜브에 20μl Fast Blue(5.26mM)를 추가합니다.
4. 튜브를 37°C로 설정된 수조 또는 가열 블록에 넣습니다.
5. 15분마다 튜브를 짧게 흔들고 튕겨 신경절이 용액으로 덮여 있는지 확인합니다.
   메모: 신경절 소화 시간은 소화 효소의 나이에 따라 다릅니다. 소화 효소를 용해 한 달 이내에 30 분 동안 소화하십시오. 2 - 6 개월 이내에 45 분 동안 소화하십시오. 효소가 6개월 이상 된 경우 60분 동안 신경절을 소화시킵니다.
6. 신경절이 소화되는 동안 입자 용액(폴리비닐피롤리돈으로 코팅된 콜로이드 실리카 입자)을 사용하여 밀도 구배를 준비합니다.
7. GaDS에 12% 입자 용액을 혼합하여 시료당 500μl를 사용합니다.
8. GaDS에 28% 입자 용액을 혼합합니다(샘플당 500μl).
9. 각 샘플에 대해 새로운 1.5ml 튜브에 400μl 28% 밀도 용액 위에 400μl 12% 밀도 용액을 천천히 조심스럽게 추가합니다. 두 레이어가 혼합되지 않도록 하십시오. 튜브에서 두 개의 뚜렷한 층이 보여야 하며 하나는 다른 것보다 더 어둡습니다.
10. 적절한 소화 시간 후, 소화 효소로 GaDS를 제거하고 1ml PBS로 신경절을 2회 세척합니다. 각 튜브에 200μl의 새로운 GaDS를 추가합니다.
11. 100μl 부피로 설정한 200μl 피펫을 사용하고 신경절을 위아래로 여러 번 피펫팅하여 세포를 분리합니다. 온전한 조직 조각이 보이지 않을 때까지 반복합니다. 용액에 거품을 만들지 마십시오.
12. 해리된 세포를 70μm 세포 스트레이너에 통과시킵니다.
13. 원래 해리 튜브에 100μl의 GaDS를 더 추가하여 남아 있는 표유 세포를 집어 들고 세포 여과기를 통해 추가 용액을 통과시킵니다. 새 피펫 팁을 사용하여 스트레이너를 통과하여 메쉬에 달라붙은 남아 있는 세포 함유 액체를 수집합니다. GaDS에 현탁된 세포의 최종 부피는 300μl입니다.
14. 300 μl의 세포를 이전에 만든 밀도 구배 위에 조심스럽게 겹쳐 놓습니다. 기포와 밀도 층과 세포의 혼합을 피하십시오.
15. 상온에서 2,900 x g에서 10분 동안 원심분리기
.
16. 원심분리가 완료되면 상단 700μl 층을 조심스럽게 제거하고 폐기합니다. 이 층에는 세포 분류를 방해할 수 있는 대부분의 세포 파편이 포함되어 있습니다.
17. 용액을 포함하는 나머지 세포에 700μl의 신선한 GaDS를 첨가하고 위아래로 여러 번 피펫하여 혼합합니다.
18. 18. 2,900 x g에서 15분 동안 펠릿 세포로 원심분리기를 가열합니다.
19. 19. 원심분리가 완료되면 상등액을 조심스럽게 제거하고 버리고 세포 펠릿을 남깁니다.
20. 200 μl로 설정된 1,000 μl 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 200 - 300 μl GaDS에 세포 펠렛을 여러 번 재현탁합니다. 얼음 위에 샘플을 넣으십시오.

표 1. Ganglia Dissociation Solution(GaDS)용 시약 혼합물.

성분	분량
고급 DMEM/f12	9.5 밀리리터
글루타민	100 μl
헤페스 (10mM)	100 μl
N2 보충제	100 μl
B27 (비타민 A 없음)	200 μL
NGF (50 μg/ml)	10 μl

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dulbecco의 인산염 완충 식염수(PBS) Ca 및 Mg 무함유	지브코	14190-144
고급 DMEM/F12	지브코	제12634-010
글루타민(Glutamax)	지브코	제35050-061
헤페스	지브코	제15630-080
엔2	지브코	제17502-048
B27 (비타민 A 없음)	지브코	제12587-010
신경 성장 인자(NGF)	시그마	N6009	PBS/10% FBS에 50μg/ml 재고
소화 효소, Liberase DH 연구 등급	로슈	5401054001	물에 2.5 mg/ml 재고
입자 용액 (Percoll)	시그마	P1644-25ML
가열 블록	랩넷
70um 셀 스트레이너	송골매	352350

년 호 호 호 호 호