검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
참고: 아래 프로토콜은 해마 절편의 장기 배양 및 간헐적 이미징을 위한 준비 및 배양 방법을 설명합니다. 플라즈마 응고를 사용하여 특별히 준비된 포토에칭 커버슬립에 해마 슬라이스 하나를 부착한 다음, 커버슬립을 롤러 인큐베이터에서 유지되는 천공된 롤러 튜브의 평평한 면에 밀봉합니다.
1. 롤러 튜브 랙의 준비
- 눈금 막대에 표시된 크기로 인쇄된 그림 1A에 표시된 템플릿을 사용합니다. 못을 사용하여 구멍 중앙의 템플릿에 작은 구멍(미세한 점 마커를 만들 수 있을 만큼 큼)을 펀칭합니다.
- 15cm 조직 배양 접시(공칭 직경 14cm)의 바닥에 템플릿을 놓고 구멍의 위치를 표시합니다. 두 번째 요리에 대해 이 작업을 반복합니다.
- 플라스틱에 사용하도록 설계된 드릴 비트를 사용하여 접시 가장자리에서 2.5cm 떨어진 구멍이 있는 육각형 배열(4.8cm 중심에서 중심까지)로 각 접시에 1.5cm 직경의 구멍 6개를 뚫습니다. 그림 3A와 같이 두 개의 큰 구멍 사이에 등거리로 배치된 가장자리에서 12mm 떨어진 곳에 세 개의 구멍(직경 1mm)을 뚫습니다.
- 각 접시의 바닥이 서로 마주 보도록 하여 작은 구멍 중 하나를 통해 평 와셔가 있는 2.5인치 길이의 기계 나사(직경 3/16인치)를 놓고 두 번째 평 와셔, 폴리에틸렌 튜빙 조각(스페이서, 4.7cm), 다른 평 와셔, 두 번째 조직 배양 접시, 다른 평 와셔, 잠금 와셔, 그리고 너트.
- 다른 두 개의 기계 나사에 대해 1.4단계를 반복하고 모든 기계 나사가 제자리에 고정될 때까지 느슨하게만 조입니다. 그런 다음 너트를 단단히 조입니다.
- 그로밋(두께 5/16인치, 구멍 직경 5/8인치)을 하단 접시의 구멍에 밀어 넣어 최종 롤러 튜브 랙을 얻습니다(그림 1B, 두 개의 튜브가 제자리에 있는 그림 참조). 각 랙에 고유 번호가 있는 스티커를 부착합니다.
2. 롤러 튜브 및 커버슬립 준비
- 롤러 튜브에 구멍을 뚫기 위한 지그 만들기
- 1.5 x 8 x 2 x 4인치 나무 블록의 중앙 면에 5.5cm 깊이의 구멍을 롤러 튜브의 평평한 면이 삽입할 때 블록과 거의 평행이 되도록 비스듬히 뚫습니다(그림 2A).
- 둥근 나무 파일을 사용하여 구멍을 확대하여 튜브를 삽입할 수 있도록 구멍을 넓히고 가늘게 합니다(롤러 튜브는 캡 끝 부분에서 직경이 약간 더 큼).(그림 2B).
- 블록 측면에서 1.5cm 떨어진 직경 5.5cm의 수직 구멍을 뚫고 측면 구멍 중앙에 구멍을 뚫습니다(그림 2C).
- 측면 구멍이 충분히 가늘어지면 원하는 지점에 표시된 롤러 튜브를 삽입하여 슬라이스 구멍의 중심에 놓고 표시된 지점이 1.5cm 수직 구멍의 중앙에 오도록 튜브를 배치합니다.
- 튜브를 제거하고 스폿에서 튜브 끝까지의 거리를 측정합니다. 지그의 구멍 중심에서 이 거리를 표시하고 드릴링을 위해 튜브를 올바르게 배치할 수 있도록 중지를 제공하는 못을 삽입합니다(그림 2C의 화살표).
- 쇠톱을 사용하여 못을 잘라 나무 블록의 표면과 같은 높이로 잘라 부상을 방지하십시오.
- 고정할 수 있는 슬롯이 있는 드릴 프레스가 있는 경우 지그 바닥에 스프링 클립을 추가합니다(그림 2D 검은색 화살표). 그렇지 않으면 C-클램프를 사용하여 지그를 드릴 프레스에 단단히 고정하십시오.
- 위에서 설명한 지그를 사용하여 평평한 면이 위로 향하게 하여 평평한 면의 11cm 플라스틱 배양 튜브를 잡고 배치하고(그림 2A) 중심이 바닥에서 1.0cm 이고 튜브 측면 사이의 중앙에 6mm 직경의 구멍을 뚫습니다.
메모: 플라스틱용으로 설계된 드릴 비트를 사용해야 합니다.
- 회전식 디버링 도구를 사용하여 구멍의 가장자리를 매끄럽게 하고(그림 2E) 구멍의 내부 가장자리(그림 2E, 삽입)에 4개의 홈을 만들어 회전 중에 구멍이 쉽게 배수되도록 합니다.
- 12mm 홀 펀치를 사용하여 무독성 양면 접착 실리콘 고무 시트에서 직경 12mm 디스크를 절단합니다. 표준 1홀 종이 펀치(직경 6mm)를 사용하여 각 디스크의 중앙에 구멍을 만듭니다.
- 천공된 튜브를 70% 에탄올로 헹구고 생물 안전 캐비닛에서 자연 건조한 다음 생물 안전 캐비닛의 자외선(UV) 램프(평균 거리 30cm에서 70W) 아래에서 튜브와 펀칭된 접착 디스크를 40분 동안 살균합니다.
- 노출된 모든 표면이 멸균되도록 20분 후에 튜브와 디스크의 위치를 변경합니다. 멸균 상태에서 접착 디스크에서 흰색 뒷면을 떼어내고 실리콘 고무를 튜브 외부에 부착하여 구멍을 정렬합니다(그림 2F).
주의: UV 노출을 피하려면 UV l을 켜기 전에 보안경을 착용하고 캐비닛을 닫으십시오.amp.
- 직경 12mm의 포토에칭(중앙 번호가 매겨진 1mm 사각형 100개) 독일 유리 커버슬립을 청소합니다. 집게로 커버슬립을 부드럽게 잡고 앱솔루트 에탄올에 담근 다음 물, 다시 앱솔루트 에탄올을 담그고 마지막으로 커버슬립을 화염에 담궈 에탄올을 태웁니다. 커버슬립을 식히십시오.
- 집게로 커버슬립을 잡고 아세톤에 2% 3-아미노프로필트리에톡시실란에 10초 동안 담그십시오. 커버슬립을 초순수로 헹구고 자연 건조시킵니다.
- 생물 안전 캐비닛 내부의 멸균 여과지에 커버슬립을 놓고 UV 광선을 켭니다. 커버슬립의 각 면을 20분 동안 노출시킵니다.
주의: UV 노출을 피하려면 UV l을 켜기 전에 보안경을 착용하고 캐비닛을 닫으십시오.amp.
3. 해마 슬라이스 준비
- 해부를 시작하기 전에 조직 다지기를 위해 양날 면도날의 반쪽을 준비하십시오. 손가락으로 칼날을 세로로 조심스럽게 접고 반으로 자릅니다.
- 면봉을 사용하여 면봉으로 칼날 반쪽을 아세톤으로 헹구어 청소한 다음 절대 에탄올로 헹구고 자연 건조합니다. 티슈 초퍼에 하프 블레이드를 장착하기 전에 70% 에탄올로 헹궈 살균하십시오.
- 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Animal Care and Use Committee)에서 승인한 프로토콜을 따르십시오. 이소플루란 마취 후 4-7일 된 쥐나 새끼 쥐를 참수형으로 안락사시키고 가위나 단두대로 머리를 제거합니다.
메모: 뇌 절편 배양 프로토콜은 마우스 또는 랫트 균주 또는 유전자형과 무관합니다. 서로 다른 유전적 배경을 가진 많은 형질전환 마우스 라인이 사용되었습니다.
- 머리를 70% 에탄올로 헹구고 60mm 페트리 접시에 넣습니다. 브레인 슬라이스가 롤러 튜브에 최종적으로 장착될 때까지, 다음 모든 단계는 무균 상태를 유지하기 위해 층류 후드에서 수행됩니다.
- #21 수술용 칼날을 사용하여 피부와 두개골을 시상으로 절단합니다. #5 Dumont 겸자로 피부와 두개골을 벗겨내어 뇌를 노출시킵니다.
- 겸자를 닫은 상태에서 뇌 전체를 부드럽게 놀리고 소뇌 뒤의 뇌간을 통해 집게로 꼬집어 뇌를 풀어줍니다. 4°C Gey's Balanced Salt Solution/0.5% 포도당(GBSS/포도당)이 들어 있는 60mm 멸균 접시에 뇌를 넣습니다.
- 해부 현미경을 사용하여 뇌를 시각화하고(그림 3A), 뇌 등쪽을 위로 향하게 놓고 수술용 칼날로 뇌의 앞쪽 1/3과 소뇌를 잘라냅니다(그림 3B).
- 겸자로 다듬어진 뇌 뒤쪽을 위로 향하게 하고 복부 쪽을 페트리 접시 쪽에 대고 안정성을 유지합니다. 시상정중선 주위의 수막을 부드럽게 떼어내고 끝이 미세한 Dumont #5 집게를 사용하여 중뇌 조직을 제거합니다(그림 3C, 점선 원).
- 뇌의 측면을 따라 두 개의 절단을 만들어 뇌를 벌립니다(그림 3C, 점선). 뇌를 등쪽이 아래로 향하게 놓고 벌리면 해마 열구가 보여야 합니다(그림 3D, 화살표).
- 펼쳐진 열린 뇌를 폴리클로로트리플루오로에틸렌 플라스틱 필름 조각으로 옮기고 조직 초퍼의 무대에서 슬라이스할 수 있도록 배치합니다. 칼날에 GBSS/포도당을 적시고 해마를 ~300μm 두께로 자릅니다.
- 전사 피펫을 사용하여 플라스틱 필름에서 얇게 썬 뇌를 GBSS/포도당이 들어 있는 새 60mm 접시에 넣습니다(그림 3E). 끝이 가는 집게로 조각(그림 3G, H)에서 남은 수막 및 기타 해마가 아닌 조직(그림 3F)을 부드럽게 꼬집어 떼어냅니다.
4. 도금 슬라이스
- 슬라이스를 얻으면 준비된 커버슬립의 포토에칭 면 중앙에 2μL의 치킨 플라즈마를 놓습니다. 플라즈마를 약간 펴서 직경 3-4mm의 스폿을 만듭니다.
메모: 포토에칭된 면은 해부 현미경을 통해 볼 때 커버슬립의 윗면으로 숫자가 올바른 방향이 되도록 합니다.
- 멸균 좁은 팁 주걱(그림 4A)을 사용하여 1개의 뇌 절편을 혈장 스폿(그림 4B)으로 옮깁니다. 닫힌 집게를 사용하여 GBSS/포도당에서 조각을 들어 올리는 동안 주걱 끝에 조각을 유지합니다.
- 주걱을 커버슬립의 플라즈마 지점에 대고 집게를 닫은 상태에서 슬라이스를 커버슬립에 밀어 넣습니다.
- 2.5μL의 혈장과 2.5μL의 트롬빈을 별도의 튜브에 혼합합니다. 이 혼합물 2.5 μL를 슬라이스 위와 주위에 빠르게 놓고 위아래로 부드럽게 피펫하여 혼합합니다(그림 4B).
메모: 혈장은 10-15초 이내에 응고되므로 이 작업을 신속하게 수행해야 합니다. 슬라이스 접착력이 문제가 되는 경우 5μL 플라즈마와 5μL 트롬빈을 혼합하고 슬라이스에 4-5μL를 사용하고 혼합 후 일부를 제거하여 슬라이스가 커버슬립에 평평하게 놓이 도록 합니다.
- 이전에 롤러 튜브에 부착된 실리콘 고무 접착제의 노출된 면에서 투명 플라스틱 덮개를 제거하고 브레인 슬라이스가 있는 커버슬립을 구멍 내의 슬라이스를 정렬하는 접착제에 놓습니다(그림 4C).
- 접착력을 확보하려면 엄지손가락으로 커버슬립을 균일하게 누르고 약 1분 동안 유지하면서 생물 안전 캐비닛으로 옮겨 커버슬립에 부드럽고 균일한 압력을 가합니다.
- 생물 안전 작업대에서 각 튜브에 0.8mL의 완전한 Neurobasal A 배양 배지(Table of Materials)를 추가합니다(그림 4D).
- 클램프로 단단히 고정된 멸균 면 플러그 파스퇴르 피펫을 통해 5% CO2/95% 공기 혼합물을 흐르게 합니다. 롤러 튜브를 가스 혼합물로 세척하고 피펫 주변에서 튜브를 빼낼 때 튜브를 빠르게 캡핑합니다.
- 튜브에 슬라이스 번호와 랙 번호를 레이블로 지정합니다. 튜브를 롤러 랙에 삽입하여 기하학적으로 균형을 이루는지 확인합니다. 튜브의 수가 홀수인 경우 튜브를 추가하여 균형을 맞춥니다.
- 약 35-10RPM(시간당 회전수)으로 롤러 랙을 돌리는 롤러가 있는 35°C 롤러 인큐베이터에 랙을 놓습니다(그림 4E). 매체를 튜브 바닥에 유지하려면 보드에서 전면을 들어 올려 인큐베이터를 약 5° 뒤로 기울입니다.
