빠른 신경관 확장 및 형성 시작기능적 신경 세포 연결

초록

출처: M. H. Magdesian et al., Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection, J. Vis. Exp. (2017)

이 비디오는 미세 유체 장치 및 미세 조작을 사용하여 뉴런의 빠른 시작 및 확장과 대상 뉴런과의 새로운 연결을 생성하는 기술을 보여줍니다. 이것은 외상 후 또는 신경 퇴행성 질환에서 신경 회로를 다시 연결하는 것을 목표로 하는 치료법에 사용될 수 있습니다.

프로토콜

1. 미세유체 소자를 이용한 신경 세포 배양의 표준화: 장치 조립

1. 원하는 실험에 적합한 미세유체 장치를 선택하십시오. 동일한 집단 내의 뉴런을 연결하려면 Neuro Devices(그림 1)를 사용하고, 다른 집단의 뉴런을 연결하려면 Co-Culture Devices(그림 2)를 사용합니다.
2. 원하는 수의 멸균 커버슬립 또는 유리 바닥 접시를 청소하고 준비합니다. 플라스틱 표면에서 최상의 결과를 얻으려면 35mm 접시를 사용하고, 유리에는 25mm 커버슬립 또는 35mm 유리 바닥 접시를 사용하십시오. 이미징 시스템에 따라 유리 두께(예: 0.15mm)를 선택합니다.
3. 접시나 커버슬립을 0.5-1mL의 100μg/mL PDL로 2시간 동안 또는 실온에서 하룻밤 동안 코팅합니다.
   메모: 여기에서 프로토콜을 일시 중지하고 원하는 경우 다음 날 다시 시작할 수 있습니다. 또한 접시는 붕산염 완충액 희석된 PDL, 폴리-L-라이신(PLL), 라미닌 또는 기타 세포 접착 분자로 코팅할 수 있습니다.
4. 접시를 물로 두 번 씻고(소금 결정이 채널을 막을 수 있으므로 인산염 완충 식염수(PBS)를 사용하지 마십시오) 모든 액체를 제거하고 생물 안전 캐비닛과 같은 멸균 환경에서 5-10분 동안 또는 표면이 완전히 마를 때까지 건조시킵니다.
   메모: 남아 있는 액체가 미세유체 시스템의 부착을 방해할 수 있으므로 커버슬립이 완전히 건조되었는지 확인하십시오.
5. 패턴이 위로 향하는 패턴이 있는 미세유체 장치를 멸균 환경(생물 안전 캐비닛)의 멸균 환경(생물 안전 캐비닛)에 10분 동안 놓습니다. 생물 안전 캐비닛에서 작업할 때는 반드시 멸균 절차를 따르십시오.10.
6. 핀셋을 사용하여 패턴이 아래를 향하도록 한 미세유체 장치를 깨끗한 커버슬립/접시와 접촉하도록 놓습니다. 핀셋을 사용하여 장치가 유리에 부착되도록 부드럽게 누릅니다.
   메모: 접착된 영역의 투명도는 빛에 대해 볼 때 볼 수 있습니다. 모든 모서리가 유리에 닿았는지 확인하십시오. 모든 미세유체 장치에 이 작업을 수행합니다. 그림 1a를 참조하십시오.
7. 단일 집단 장치를 배지로 채우려면 피펫을 채널 쪽으로 향하게 하고 무혈청 B-27(부피 비율 1:50) 및 500μg/mL 페니실린/스트렙토마이신/글루타민(총칭하여 NBM이라고 함)이 보충된 50μL의 완전한 세포 배지를 오른쪽 상단 웰에 추가한 다음 대각선으로 놓인 웰에 50μL를 더 추가합니다. 모든 장치에 대해 이 작업을 수행하여 매체가 우물 사이로 흐르는지 확인합니다. 다음으로, 나머지 두 웰에 50μL의 배지를 추가합니다. 그림 3a를 참조하십시오.
   1. Multiple population 장치를 medium으로 채우려면 피펫을 채널 쪽으로 향하게 하고 오른쪽 well에 30μL의 완전한 NBM을 추가합니다(그림 2a 참조). 모든 장치에 대해 이 작업을 수행하여 매체가 우물 사이로 흐르는지 확인합니다. 다음으로, 나머지 4개의 웰에 50μL의 배지를 추가합니다.
8. 고압 멸균 된 물 (습식 챔버)이 열린 접시가있는 더 큰 접시에 장치를 놓고 세포 배양을 준비하는 동안 1-2 시간 동안 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO₂ 및 95 % 습도)에 놓습니다. 그림 3b를 참조하십시오.

2. 미세유체 시스템에서 도금 뉴런

1. 프로토콜에 따라 Sprague Dawley 쥐 배아(성별 모두)에서 해리된 해마 또는 피질 뉴런을 얻습니다.
2. NBM에서 배아 뉴런을 1-200만 뉴런/mL의 농도로 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 현미경에서 세포 농도를 확인하고 참고 문헌8을 따릅니다. 원하는 세포 밀도에 따라 세포 농도를 조정합니다. 채널당 단일 해마 축삭돌기를 얻을 가능성을 높이려면 장치당 10,000개의 뉴런을 플레이트화합니다. 동일한 채널에 여러 개의 축삭돌기를 가지려면 장치당 60,000개의 뉴런을 플레이트화하십시오.
   참고: 이 숫자는 사용된 뉴런 유형에 따라 다릅니다.
3. 우물을 비우지 않고 미세유체 장치에서 매체를 제거합니다. 각각 약 5μL를 남겨둡니다.
4. 단일 집단 장치에서 세포를 플레이트링하려면 오른쪽 하단 웰에 50μL의 NBM을 추가합니다. 이 시점에서 매체는 자체적으로 흐르며 다른 낮은 우물을 채웁니다. 농축 셀 용액 20μL를 그림 1b에 표시된 대로 미세유체 장치의 오른쪽 상단 웰에 추가합니다.
   1. 다중 집단 장치에서 세포를 플레이트화하려면 농축 세포 용액 20μL를 그림 2a의 각 오른쪽 웰에 추가합니다.
5. 세포가 챔버 내부에 있는지 현미경으로 확인하고 장치를 15-30분 동안 인큐베이터에 넣어 세포가 기질에 부착되도록 합니다.
6. 챔버에 충분한 세포가 있는지 현미경으로 확인하십시오. 더 필요한 경우 2.4단계와 2.5단계를 반복합니다.
7. 단일 집단 장치의 2개 상단 웰에 50μL의 NBM을 추가하고 다중 집단 장치에 세포를 주입한 것과 동일한 웰에 20μL의 NBM을 추가합니다. 배지는 약간 돌출되어 양성 반월판을 형성하여 우물에 머핀 상단 측면을 제공합니다. 다시 그림 3a를 참조하십시오.
8. 셀을 37°C, 5%CO₂ 및 95% 습도로 유지합니다.

3. 뉴런 배양 유지

1. 세포에서 NBM(피펫 사용 시 약 30μL)을 제거하고 장치에 도입된 다음 날(즉, 2단계 후 1d)에 새로운 예열 NBM을 적용합니다.
2. 각 채널에 매체가 충분한지 2일마다 확인하십시오. 머핀 상단이 낮으면 상단 웰에 중간을 더 추가하십시오.
3. 미세유체 장치를 제거하기 전에 최소 7일 동안 세포를 배양합니다. 세포는 이러한 장치에서 몇 주 동안 생존할 수 있습니다. 샘플에 대한 실험을 수행하기 1-2일 전에 장치를 제거하십시오.

4. 미세유체 소자 제거

1. 미세유체 장치를 제거하기 1 - 2일 전에 각 샘플 접시에 37°C로 예열된 NBM 2mL를 추가하여 챔버를 가득 채우고 인큐베이터에서 장치를 유지합니다.
2. 멸균 핀셋과 하나의 팁을 사용하여 커버슬립에서 미세유체 장치를 제거하여 패턴화된 뉴런 구성을 남깁니다. 팁을 사용하여 커버슬립을 제자리에 고정하고 핀셋을 사용하여 우물의 왼쪽 하단 모서리에 있는 장치의 가장자리를 잡습니다. 조심스럽게 비틀림을 가하고 핀셋으로 장치를 들어 올려 커버 슬립을 벗겨냅니다. 그림 3c-3d를 참조하십시오.
3. 2-3일마다 샘플이 실험에 사용될 때까지 NBM의 절반을 교체하십시오.
4. 샘플에 대한 배선 변경 실험을 수행하기 전에 현미경으로 단일 집단 장치 채널의 신경돌기와 다중 집단 장치의 신경 세포 집단이 분리되어 있는지 확인하여 신경 세포 집단을 연결하는 필라멘트가 없는지 확인합니다.

>5. PDL 코팅 비드 준비

1. 물에 희석한 4, 10 또는 20μm 폴리스티렌 비드 2 x 50 μL 방울(1:500)을 1mL의 PDL(100 μg/mL)에 추가합니다. 실온에서 최소 2시간 동안 그대로 두십시오.
   참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지하고 다음 날 다시 시작할 수 있습니다.
2. 용액을 8,820 x g에서 1분 동안 원심분리하고 용기 바닥에 쌓인 비드를 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
3. 멸균 10mM HEPES pH 8.4 용액 1mL로 비드를 두 번 세척합니다.
4. PDL 코팅 비드를 200mL의 10mM HEPES pH 8.4 용액에 재현탁합니다.

6. 마이크로파이펫 준비

1. 수평 전극 풀러를 사용하여 유리 모세관 튜브(내경 1mm, 외경 1.5mm)에서 피펫을 준비합니다. 당겨진 마이크로피펫의 바깥쪽 끝이 ~ 2-5 μm가 되도록 설정을 조정합니다. 당기기 전에 유리관이 깨끗한지 확인하십시오.
2. 보관을 위해 피펫을 유리 슬라이드에 고정하고 팁이 깨지기 쉬우므로 팁이 슬라이드 표면에 닿지 않도록 합니다. 먼지로부터 보호하기 위해 뚜껑이 있는 용기에 실온에 보관하십시오. 피펫을 뽑은 당일에 사용하십시오.

7. 뉴런에 대한 PDL-bead 접착

1. 5단계에서 준비한 40-60 μL의 PDL 코팅 비드를 4단계에서 준비한 세포 배양에 추가합니다. 피펫 팁을 커버슬립에서 희미하게 보이는 뉴런 위에 놓고 비드를 추가합니다(그림 4 참조).
2. 시냅스 접촉의 형성을 촉진하기 위해 샘플을 1시간 동안 인큐베이터에 반환합니다.
3. 배양 후 예열된 NBM으로 배양물을 부드럽게 세척하여 부착되지 않은 비드를 제거합니다.

8. 생리식염수 준비(실온 실험용)

1. 생리식염수를 준비합니다. 이는 인큐베이터 외부의 세포 환경을 조절하기 위함입니다.
2. 삼투압 및 pH 수준을 확인합니다.
3. 실험을 수행하는 동안 pH 변동을 최소화하기 위해 용액에 O₂ 를 지속적으로 주입합니다.
4. 실온으로 가열합니다.
5. 플라스틱 튜브(옵션 치수)의 한쪽 끝을 O₂ 주입 생리학적 용액에 삽입하고 다른 쪽 끝을 샘플 홀더에 삽입된 바늘에 고정하여 관류 시스템을 설정합니다. 튜브와 용액을 샘플보다 높게 놓습니다(그림 5 참조).
   1. 바늘에서 튜브를 분리하고 주사기에 연결합니다. 주사기를 사용하여 압력을 가하고 액체를 끌어당겨 튜브를 채웁니다. 롤러 cl로 밀봉amp 바늘을 다시 연결하십시오.

9. 비드 미세 조작

1. 실험 설정에 샘플을 설치하여 micromanipulator에 장착된 두 개의 마이크로피펫을 통해 위에서 세포에 액세스할 수 있고 예를 들어 도립 광학 현미경의 40X 위상 대물렌즈(개구수 0.6)를 사용하여 아래에서 광학적으로 액세스할 수 있습니다. 이 구성에서는 이미지 캡처를 위한 CCD 카메라를 현미경의 측면 포트에 장착합니다. 플라스틱 튜브를 통해 각 피펫을 1mL 주사기에 연결합니다. 이 단계에서 NBM을 생리식염수(1-2mL)로 교체합니다(그림 5 참조).
2. 실험하는 동안 8단계에서 준비한 생리식염수를 0.5-1mL/분의 속도로 세포에 지속적으로 관류시켰습니다.
3. 시야에서 뉴런에 부착되지 않은 PDL 비드를 선택합니다. 비드에 초점을 맞춘 다음 마이크로피펫까지 초점을 맞춰 비드를 마이크로피펫 팁에 맞춥니다. 현미경을 통해 팁을 모니터링하여 비드에 최대한 가깝게 팁을 가져옵니다.
4. 피펫에 연결된 1mL 주사기로 음압을 가하여 비드를 픽업합니다. 실험 내내 음압을 유지합니다.

10. 신경암 당기기

1. 시야에서 뉴런에 부착된 PDL 비드를 선택하고 9.3-9.4단계에 설명된 대로 흡입을 사용하여 두 번째 마이크로피펫에 부착합니다.
2. PDL-비드-뉴런 복합체를 천천히(~0.5μm/분) 당겨 마이크로매니퓰레이터 또는 샘플 스테이지를 1μm 이동하고 신경돌기가 시작될 수 있도록 5분 동안 일시 중지합니다.
3. 10.2단계를 두 번 반복합니다.
   참고: 실험 성공을 보장하기 위해 처음 3μm를 매우 천천히 당겨야 하며, 이는 95% 이상의 시간 동안 발생합니다.
4. PDL-비드-뉴런 복합체를 미세조작기 또는 샘플 스테이지를 2μm 이동시키면서(~0.5 μm/분) 당기고 신경돌기가 늘어날 수 있도록 5분 동안 멈춥니다.
5. 처음 5μm에 대한 성공적인 시작 및 신경돌기 확장 후 밀리미터 규모의 거리에서 20μm/분의 속도로 신경돌기를 당깁니다.
   참고: 당기기(pull)는 연속적으로 또는 단계적으로 다양한 속도로 수행할 수 있습니다. 그림 6b-6c를 참조하십시오.

11. 뉴런 연결

1. 신경돌기가 풍부한 영역을 선택하고 PDL-비드-신경돌기 복합체를 낮추어 물리적으로 접촉하도록 합니다. 다른 비드를 사용하여 커버슬립 표면 위의 팁 높이를 측정합니다. 그림 6d를 참조하십시오.
2. PDL-비드-신경돌기 복합체를 타겟 신경돌기와 접촉하도록 두면서 두 번째 마이크로피펫을 조작합니다. 첫 번째 비드에서 약 20μm 떨어진 새로 형성된 신경돌기 위에 두 번째 PDL-비드를 놓고 두 번째 피펫을 내립니다. 두 번째 PDL-비드를 사용하여 새로운 신경돌기 필라멘트를 표적 세포 쪽으로 밀어 넣습니다.
3. 두 비드를 최소 1시간 동안 제자리에 유지합니다. 현미경으로 비드와 접촉하는 신경돌기가 두꺼워지는 국소 팽창이 없는지 확인합니다16.
4. 이 시간 동안 관류를 사용하여 샘플의 매체를 생리적 식염수에서 예열된 CO₂ 평형 NBM으로 천천히 변경합니다.
5. 흡입을 해제하여 두 번째 피펫에서 비드를 분리합니다. 새 신경돌기가 부착된 상태로 남아 있으면 첫 번째 비드도 해제합니다. 그림 6e를 참조하십시오.
6. 식염수를 부드럽게 제거하고 NBM(~2mL)으로 대체합니다.
7. 향후 실험을 위해 뉴런 연결을 강화하기 위해 샘플을 조심스럽게 인큐베이터에 다시 넣으십시오. 이 연결은 >24 동안 안정적입니다
.

결과

그림 1: 미세유체 소자를 사용한 신경 배양의 표준화7. (a) 장치 조립: 미세유체 장치가 건조한 표면에 적절하게 조립되면 모든 챔버가 보입니다. (b) 세포 도금: 오른쪽 상단의 세포를 플레이트에 넣고 세포가 왼쪽 웰로 이동해야 합니다. (c) 세포 밀도 : 도금 직후 현미경으로 세포의 농도가 적절한지 확인하십시오. (d) 배양 1일 후, 해마 뉴런은 미세채널 가까이에 잘 부착되어 신경돌기를 형성하기 시작합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
신경 장치	아난다 장치		http:// www.anandadevices.com 에서 상업적으로 이용 가능
No. 1 유리 커버슬립 25mm 라운드	워너 인스트루먼트	Tel.: 64-0705
35mm 세포 배양 접시, 비발열성, 멸균	코닝 Inc	430165
95mm x 15mm 페트리 접시, 미끄러질 수 있는 뚜껑, 멸균 폴리스티렌	피셔브랜드	FB0875714G
Neurobasal 배지	생명 기술	제21103-049	세포외 솔루션
B-27 보충제 (50X), 무혈청	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	17504044	세포외 솔루션
페니실린, 스트렙토묘신, 글루타민	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	11995-065	세포외 솔루션
2 - 20 μL 피펫터 에어로졸 저항 팁	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	2149피
Dumont 듀모스 스타 핀셋 11cm	세계적인 정밀 기기	500233
해부 도구	브라운, 애스큘라프
Poly-D-lysine 하이드로 브로마이드	시그마-알드리치	P6407
폴리스티렌 기반 미세 입자, 10μm	시그마-알드리치	72986
수평 피펫 풀러	셔터 기기	브라운 플레이밍 P-97
마이크로 매니퓰레이터, PCS-5000 시리즈 MC7600R	SD 기기	MC7600R
1mL 주사기	BD 루어록	309628
도립 현미경	올림푸스	익스71
객관적 UIS2	올림푸스	루플플른 40X
CCD 카메라	포토메트릭스	캐스케이드 II: 512

호 ) ) 년 )