인간 피부 섬유아세포 리프로그래밍을 통한 뉴런 생성

초록

출처: Shrigley, S., et al. 인간 성인 피부 섬유아세포에서 유도 뉴런의 고수율 배양의 단순 생성. J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오는 성인 인간 진피 섬유아세포(aHDF)의 뉴런 생성을 보여줍니다. aHDF는 뉴런 전사 인자(neuronal transcription factor)와 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA, shRNA)에 대한 유전자를 운반하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 재프로그래밍됩니다. shRNA는 뉴런 전사 억제인자(neuronal transcriptional repressor)의 발현을 억제하고, 뉴런 전사 인자(neuronal transcription factor)는 aHDF를 뉴런으로 분화하기 위해 유전자를 활성화합니다. 이러한 재프로그래밍된 aHDF는 성숙한 뉴런을 생성하기 위해 초기 및 후기 뉴런 변환 배지에서 배양됩니다.

프로토콜

1. 리프로그래밍을 위한 피부 섬유아세포의 준비

1. 자동 세포 해동 시스템 또는 37°C 수조를 사용하여 성인 인간 진피 섬유아세포(aHDF)와 플레이트당 200,000을 37°C에서 37°C의 섬유아세포 배지(표 1 참조)에 5%_CO2
로 해동합니다.
2. 다음 날 섬유아세포 배지로 완전한 배지 변경을 수행합니다.
3. 세포가 95% confluency.
   에 도달할 때까지 3-4일마다 섬유아세포 배지를 교체하십시오. 메모: 하나의 융합 플라스크에는 약 1,000,000개의 세포가 포함됩니다.

2. 리프로그래밍을 위한 도금 (Day -1)

참고: 단기 실험(최대 30일)에는 젤라틴 코팅을 사용하는 것이 좋습니다. 또는 장기 실험의 경우 폴리-L-오르니틴, 피브로넥틴 및 라미닌(PFL) 코팅으로 시작하는 것이 좋습니다.

1. 재프로그래밍을 위해 aHDF를 도금하기 60분 전에 24웰 플레이트에 0.1% 젤라틴(250μL/웰)을 코팅하고 37°C에서 배양합니다.
2. aHDF에서 섬유아세포 배지를 흡인합니다. Dulbecco의 인산염 완충액 식염수(DPBS)로 한 번 세척합니다. 37°C에서 3-5분 동안 0.05% 트립신(T75 플라스크당 1.5mL)으로 세포를 해리합니다.
3. 섬유아세포 배지를 추가하여 트립신을 중화하고(T75 플라스크당 플러시당 3mL) 플라스크의 세포를 두 번 플러시하여 분리된 세포를 15mL 튜브에 수집합니다.
5
4. 분 동안 400 x g에서 세포를 스핀다운합니다. 상층액을 버리고 세포 펠렛을 1mL의 섬유아세포 배지에 재현탁합니다.
5. 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다(좋은 품질 변환을 보장하기 위해 트리판 블루 염색으로 세포 생존율이 90% 이상인지 확인).
6. 완전한 24-well 플레이트의 경우, 13.2mL의 섬유아세포 배지에 1,320,000개의 세포를 현탁액으로 준비하여 100,000 cells/mL의 배지(또는 550 μL의 섬유아세포 배지에 55,000 cells/well에 필요한 웰 수를 곱한 값)의 현탁액을 달성합니다.
7. 접시에서 젤라틴을 흡입하고 DPBS로 두 번 씻습니다. 각 웰에 500μL의 세포 현탁액을 추가하고 37°C에서 5% CO₂로 밤새 배양합니다.

3. 바이러스 전달(0일차)

참고: 렌티바이러스 입자를 다루기 위해서는 카테고리 2 장비와 바이러스를 중화하기 위한 약제의 사용이 필요합니다. 두 켤레의 장갑을 착용하는 것도 강력히 권장됩니다.

1. 섬유아세포 배지 13.2mL를 37°C로 예열합니다.
2. 전사 인자 achaete-scute family bHLH transcription factor 1 (Ascl1) 및 Brn2를 포함하는 lentiviral 벡터를 실온에서 RE1-silencing transcription factor (REST)를 표적으로 하는 두 개의 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)로 해동합니다.
3. transduction enhancers 없이 배지에 20의 MOI(Multiplicity of Infection)로 aHDF를 감염시키는 데 필요한 양의 렌티바이러스를 추가합니다.
   
4. 24-well 플레이트의 배지를 렌티바이러스 벡터(500μL/well)를 포함하는 섬유아세포 배지로 교체하고 37°C에서 5% CO₂로 밤새 배양합니다.
5. 다음날, 웰의 배지를 렌티바이러스 벡터가 없는 새로운 섬유아세포 배지로 교체하십시오.
   메모: 배지는 7일 동안 전염성이 있는 것으로 간주되므로 바이러스 전달 후 첫 주 동안 적절한 보호 및 취급 절차를 사용해야 합니다.

4. 변환 셀의 유지 관리

참고: 일단 변환이 시작되면 세포가 들이켜지기 쉽습니다. 배지를 제거할 때 세포가 분리되는 것을 방지하기 위해 플레이트를 기울여 올리고 1,000 μL 피펫을 사용하십시오.

1. 3일차에 섬유아세포 배지를 제거하고 500μL의 초기 신경세포 변환 배지를 추가합니다(표 1 참조).
2. 일주일에 2-3회, 우물에서 225μL의 오래된 배지를 꺼내고 250μL의 신선한 초기 신경 전환 배지를 추가합니다.
3. 18일째에 각 웰에서 모든 배지를 제거하고 500μL의 후기 뉴런 변환 배지로 교체합니다(표 1 참조).
4. 위와 같이 배지의 절반을 계속 변경하고 25일 또는 실험 종말까지 2-3일마다 후기 뉴런 변환 배지를 사용합니다(그림 1A).

표 1. 사용된 다양한 매체의 구성. 섬유아세포 배지, 초기 신경 전환 배지, 후기 신경 전환 배지를 포함하여 이 프로토콜에 필요한 매체의 구성에 대한 전체 설명.

표시기

	재고 집중도	작업 집중
섬유아세포 매체
기초 매체	해당 사항 없음	해당 사항 없음
페니실린/스트렙토마이신	10,000U/mL	100 마그네슘 / mL
FBS(증권 시세	해당 사항 없음	10%
초기 신경 전환 매체(ENM)
신경 분화 매체	해당 사항 없음	해당 사항 없음
페니실린/스트렙토마이신	10,000U/mL	100 마그네슘 / mL
CHIR99021	10 밀리미터미터	2 μM
SB-431542	20 밀리미터미터	10 μM
머리	100 μg/mL	0.5 μg/mL
LDN-1931189	10 밀리미터미터	0.5 μM의
VPA는	1 미터	1 밀리엠
LM-22A4	20 밀리미터미터	2 μM
지그엔프	20 μg/mL	2ng/mL
NT3	10 μg/mL	10 ng/μL
db-캠프	50 밀리미터.	0.5 밀리미터.
후기 신경 전환 배지(LNM)
신경 분화 매체	해당 사항 없음	해당 사항 없음
페니실린/스트렙토마이신	10,000U/mL	100 마그네슘 / mL
LM-22A4	20 밀리미터미터	2 μM
지그엔프	20 μg/mL	2ng/mL
NT3	10 μg/mL	10 ng/μL
db-캠프	50 밀리미터.	0.5 밀리미터.

결과

그림 1: 시간 경과에 따른 iN 변환의 진화.(A) 성인 인간 피부 섬유아세포를 재프로그래밍하는 데 사용되는 렌티바이러스에 포장된 구조물의 실험 타임라인 및 지도. 각 검은색 화살표는 중간 변화를 나타냅니다. (B) 0일째부터 22일째 사이의 변환 과정 동안 세포의 형태 변화를 묘사하는 대표적인 위상차 이미지(각 패널의 오른쪽 상단 모서리에 표시된 바와 같이). 이미지는 10X 대물렌즈를 사용하여 위상차 현미경으로 촬영했습니다. (C) transduction 후 35일째에 TAU 및 MAP2 이중 염색의 면역형광 이미지. 세포를 4% 파라포름알데히드에 고정하고 10분 동안 DPBS에서 0.1% 트리톤으로 투과화시켰습니다. 세포는...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
세포주
성인 인간 피부 섬유아세포			[C2 단락 #7] 기증자는 67세 여성이었다. John van Geest Centre for Brain Repair(영국 케임브리지)의 파킨슨병 연구 및 헌팅턴병 클리닉에서 얻은 세포.
섬유아세포 배양, 형질도입 및 전환을 위한 시약
둘베코의 인산염 완충 식염수(DPBS) [-CaCl2, -MgCl2]	지브코	14190094
트립신-EDTA [0.5%]	지브코	제15400-054	DPBS를 0.05%로 희석합니다.
Virkon(바이러스를 중화하는 데 사용되는 약제)	바이로더름	7511	따뜻한 물로 1% 용액으로 희석하십시오.
Milli-Q 워터	밀리포어
기초 배지 - Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMax	지브코	61965059
페니실린/스트렙토마이신 [10,000 U/ mL]	지브코	15140-122
소 태아 세럼(FBS)	지브코	10270-106
CryoMACS® 디메틸 설폭사이드(DMSO) 10	밀테니	Tel.: 170-076-303
신경 분화 매질 - NDiff 227	타카라-클론텍	Y40002
LM-22A4	토크리스	4607	1450 μL DMSO. 에 10 mg을 희석합니다. 재고 농도 : 20 mM.
신경교세포주 유래 신경영양인자(GDNF) [재조합 인간]	R&D 시스템	212-GD-010	10ug를 500μL, DPBS로 0,1% BSA로 희석합니다. 재고 농도 : 20 μg / mL.
NT3 [재조합 인간]	R&D 시스템	제267-N3-025	25mL에 2μg을 희석하고 DPBS에 0,1% BSA를 희석합니다. 재고 농도 : 10 μg / mL.
db-캠프	시그마 알드리치	D0627	1g을 40,7mL Milli-Q 물에 희석합니다. 여과하고 500μL 분취액 또는 10mL의 스톡 튜브를 만듭니다. 재고 농도 : 50 mM.
CHIR99021	축 삭	1386	429,8μL DMSO. 에 2μg 희석 재고 농도 : 10 mM.
LDN-193189	축 삭	1509	360μL DMSO. 에 2mg을 희석합니다. 재고 농도 : 10 mM.
발프로산 나트륨염(VPA)	머크 밀리포어	676380	5g을 Milli-Q 물에 희석하여 1M의 저장 농도를 달성합니다. 주의: 섭취, 피부 접촉 및 분진 형성을 흡입하지 마십시오.
코팅용 시약
젤라틴	시그마 알드리치	G2500	Milli-Q 물에 0.1%로 희석합니다.
폴리-L-오르니틴	시그마 알드리치	P3655	Milli-Q 물에 녹입니다. 15μg/mL에서 사용합니다.
피브로넥틴	써모피셔 사이언티픽	제33010-018	Milli-Q 물 2mL + 70μL 0,25M NaOH. 5μg/mL에서 사용합니다.
라미닌	써모피셔 사이언티픽	23017-015	-80°C에서 보관. 얼음에서 해동하고 식힌 후 30μL를 분취합니다. 5μg/mL에서 사용합니다.
설비
T75 플라스크 [Nunclon 델타 표면]	써모피셔 사이언티픽	156499
24웰 플레이트[Nunc]	써모피셔 사이언티픽	142485
1.5mL 폴리프로필렌 튜브	시그마 알드리치	Z336769
15 mL 팔콘 튜브	사르슈테트	6,25,54,502
50 mL 팔콘 튜브	사르슈테트	6,25,47,254
피펫 컨트롤러			피펫팅 용량 1-25 mL.
멸균 혈청학적 피펫: 5, 10 및 25 mL	사르슈테트	86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001
조절 가능한 부피 피펫터: 5, 20, 200 및 1,000 μL
멸균 피펫 팁			0.5 - 1,000 μL의 피펫팅 부피용.
ThawSTAR 자동 세포 해동 시스템	바이오시전	BCS-601
Countess II 자동 세포 계수기	써모피셔 사이언티픽	AMQAX1000
세포 계수실[50슬라이드] 및 트리판 블루[0.4%]	써모피셔 사이언티픽	C10228	Countess II 자동 세포 계수기와 함께 사용합니다.
층류 후드
가습 5% CO2 37 °C 인큐베이터
원심 분리기			1,5, 15 및 50 mL 튜브에 적합합니다.
오비탈 쉐이커
도립 형광 현미경	라이카	DMI6000 B