검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 사전 슬라이싱 준비
- 계획된 종양 절제 및 조직 채취 전날에 "조직 처리" 배지 및 "슬라이스 배양 유지" 배지를 준비합니다(또는 2주 이내에 이전에 생성된 배지 활용). 500mL의 고혈당 둘레베코의 변형된 이글 배지(DMEM)에 페니실린-스트렙토마이신 용액(10,000 U/mL)과 1M 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 5mL를 첨가하여 조직 처리 배지를 생성합니다.
- 페놀 레드가 없는 뉴런 배지(예: Neurobasal)의 베이스를 사용하여 250mL의 슬라이스 배양 유지 배지를 준비합니다. 이 배지에 10mM HEPES, 1x B-27 보충제, 400μM L-글루타민, 600μM L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드, 60U/mL 페니실린, 60μg/mL 스트렙토마이신 및 6U/mL 니스타틴을 보충합니다.
- 모든 배지는 4°C에서 2주 이상 보관하지 마십시오.
2. 수술의 날: 조직 채취
- 조직 채취 당일, 층류 후드에서 오토클레이브 유리 용기와 멸균 기술을 사용하여 조직 처리 매체에 낮은 용융 온도의 1% 및 2%(wt/vol %) 용액 50 - 100mL를 준비합니다. 종양 조직 일관성의 예측할 수 없는 변화를 수용하기 위해 두 농도의 아가로스가 모두 필요합니다.
- 부드럽게 끓는 것이 관찰될 때까지 전자레인지를 사용하여 아가로스 현탁액을 가열합니다. 아가로스 용액을 37°C 수조에 넣어 사용할 때까지 액체 상태를 유지합니다.
- 1mL의 slice 배양 유지 배지를 6웰 플레이트의 각 웰에 놓습니다.
- 멸균 집게를 사용하여 각 웰에 빈 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 배양 삽입물을 놓습니다. 플레이트를 37°C에서 유지되는 5% CO2 분위기의 가습된 워터 재킷 조직 배양 인큐베이터에 놓습니다.
- 층류 후드에 있는 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 종양 조직을 획득하기 전에 약 15-30분 동안 95% O2/5% CO2 가스 혼합물을 얼음 차가운 조직 처리 매체가 들어 있는 플라스크에 거품을 냅니다. 초산소화 매체의 사용은 가공 중 벌크 조직의 저산소증을 최소화합니다.
- 수술실과 절단 시설 사이에서 조직을 운반하기 위해 20mL의 초산소화 빙냉 처리 매체를 포함하는 라벨링된 50mL 원뿔형 튜브(원하는 수의 개별 종양 부위를 분리하기에 충분)를 준비합니다.
- 신경외과 의사와 함께 수술 전 샘플 채취를 위한 종양 부위를 계획합니다. 환자의 임상 영상(T1 가돌리늄 후 자기 공명 영상(MRI) 서열)에서 입증된 대로 조영제 향상이 있는 종양 영역을 선택합니다. 이전 경험에 따르면 이 부위는 괴사 조직과 반대로 생존 가능한 종양 조직을 생성합니다.
메모: 주위(주위) 백질에서 절편의 생성을 시도했습니다. 그러나 배경 자가형광과 종양 세포 밀도 감소로 인해 이러한 절편의 실험적 유용성이 제한되었습니다.
- 종양 절제 초기에 종양 조직을 확보합니다. 광범위한 양극성 소작술에 노출된 종양 조직의 채취를 피하십시오. 이는 열 손상으로 인한 조직 생존력을 손상시킬 수 있습니다. 단편적 종양 절제 중에 얻은 조직 샘플은 장시간의 일괄적 절제술로 얻은 조직과 비교할 때 향상된 생존력을 보여줍니다. 이 관찰은 외과적 절제술로 인한 차등 종양 조직 혈류 박탈 및 획득 시간 연장과 관련이 있을 수 있습니다.
- 원하는 경우 종양 조직에 라벨을 부착하고 별도의 원뿔형 튜브에 보관하여 별개의 종양 영역에서 샘플을 분리합니다. (즉, 표재성 vs. 깊은 종양 조직). 수술 중 수술 내비게이션을 사용할 수 있는 경우 정확한 조직 위치를 기록할 수 있습니다.
3. 슬라이스 배양 준비
- 종양 조직 조각을 얼음처럼 차가운 처리 매체가 있는 페트리 접시에 넣습니다. 종양 조직을 세척하고 부착된 적혈구를 최소화하려면 피펫을 사용하여 페트리 접시의 배지를 세 번 부드럽게 교환하고 폐기합니다.
- 메스를 사용하여 종양 조각을 직사각형 상자 모양으로 자릅니다. 티슈 조각을 약 3mm x 3mm x 10mm로 자릅니다. 절제 또는 가는 집게로 부드럽게 당겨 부착된 혈관을 조심스럽게 제거합니다.
- 37 ° C의 피펫 5 - 7 mL를 작은 입방체 모양 (~ 2 cm3) 플라스틱 임베딩 몰드에 넣습니다. 사용하기 전에 멸균 온도계로 아가로스 용액의 온도가 37°C 이하인지 확인하십시오.
- 아가로스를 얼음 바닥에 약 1분 동안 그대로 두십시오.
- 2 - 4개의 종양 조직 "스트립"을 장축이 수직 방향인 아가로스에 놓습니다. 메모: 조직 스트립은 응고되기 전에 아가로스에서 "가라앉는" 경향이 있습니다. 이 합병증을 피하려면 아가로스가 더 응고될 때까지 조직 스트립을 수직 방향으로 임시로 잡으십시오.
- 아가로스 곰팡이가 포함된 조직을 얼음 바닥에 2-5분 동안 보관하여 응고를 촉진합니다.
- 얼음에서 곰팡이를 제거하고 메스로 형태의 측면을 잘라 아가로스 블록을 부드럽게 제거합니다. 아가로스를 골절시킬 수 있는 블록에 과도한 힘을 가하지 마십시오.
- 시아노아크릴레이트 접착제를 넉넉하게 떨어뜨려 아가로스 블록을 비브라톰 표본 플레이트에 부착합니다. 접착제를 약 1 - 2분 동안 굳힙니다.
- 비브라톰 저장소를 얼음처럼 차가운 처리 매체로 채워 표본 플레이트에 부착된 아가로스 블록을 담그십시오.
- 슬라이스하는 동안 트리밍된 멸균 플라스틱 피펫을 통해 95% O2 / 5% CO2 가스 혼합물을 진동 저장소로 거품을 냅니다.
- 비브라톰 슬라이스 두께를 300 - 350 μm로 설정합니다.
- 조직의 일관성에 따라 블레이드 진행 속도와 블레이드 진폭을 조정합니다."더 뻣뻣한" 교모세포종 조직은 더 느린 블레이드 진행 속도와 더 높은 진폭을 필요로 합니다. 정확한 블레이드 속도 및 진폭 설정은 진동 사양에 따라 다릅니다.
메모: 슬라이싱 중에 일반적으로 몇 가지 문제가 발생합니다. 조직 스트립이 아가로스 블록에서 떨어져 나오면 조직을 더 높은 농도의 아가로스에 삽입해 보십시오. 종양 절편이 원하는 것보다 두껍거나(기계 세트) 비대칭인 경우 amp위도를 높이고 진동 블레이드의 속도를 줄입니다. 절단이 발생할 때 종양 조직이 칼날 홀더에 달라붙거나 "끌리지" 않도록 하려면 칼날이 움직일 때 칼날 홀더와 슬라이스 사이에 마이크로주걱을 조심스럽게 배치하십시오.
- 조직 조각을 스테인리스 스틸 마이크로 주걱을 사용하여 얼음처럼 차가운 처리 매체를 사용하여 페트리 접시로 옮깁니다.
- 인큐베이터에서 PTFE 인서트와 평형화된 슬라이스 배양 배지를 포함하는 6웰 플레이트를 얻습니다(섹션 2, 단계 4에서 준비).
- 스테인리스 스틸 마이크로주걱을 사용하여 조직 조각을 플레이트합니다. 작고 미세한 강모 페인트 브러시를 사용하여 "유체 파동"을 생성하여 주걱에서 슬라이스를 부드럽게 밀어 배양 삽입물로 밀어 냄으로써 조직의 직접 접촉 및 조작을 최소화합니다.
메모: 조직 배양 삽입물 위에 도입되는 처리 매체의 양을 최소화합니다. 과도한 양의 매체가 전송되어 조각이 떠오르는 경우 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 매체를 제거하십시오.
- 종양 절편이 포함된 6웰 플레이트를 37°C에서 5% CO2 대기로 유지되는 인큐베이터로 되돌립니다.
메모: 전체 임베딩 및 슬라이싱 프로토콜은 수술실에서 종양 조직을 채취한 후 90분 이내에 완료되어야 합니다.
4. 슬라이스 배양 유지 관리
- 12 - 24시간 후, 멸균 집게로 각 삽입 테두리를 잡고 슬라이스 배양물을 옮기고 새로운 슬라이스 배양 유지 배지가 들어 있는 플레이트로 옮깁니다. 삽입물을 옮기기 전에 각 웰에 분주된 slice culture 유지 관리 매체가 incubator에서 최소 15분 동안 평형을 이루는지 확인합니다.
- 48시간마다 새로운 평형 슬라이스 배양 배지가 있는 새로운 6-well 플레이트로 인서트를 이동합니다.
- 원하는 경우, 생화학 분석에 즉시 사용할 수 있도록 피펫으로 오래된 슬라이스 배양 배지를 분취하거나 나중에 사용할 수 있도록 -80°C에서 동결합니다.
