인간 혈액-뇌 장벽의 삼중 세포 배양 모델 개발

초록

출처: Fattakhov, N., et al. 체외 허혈성 뇌졸중 연구를 위한 인간 혈액-뇌 장벽의 삼중 1차 세포 배양 모델. J. Vis. 특급.(2022년)

이 비디오는 인간의 뇌 주위 세포, 성상 세포 및 내피 세포의 공동 배양을 보여줍니다. 각 세포층은 개별적으로 형성된 다음 함께 배양되어 혈액-뇌 장벽의 세포 배열을 모방한 3층 시스템을 만듭니다

프로토콜

1. 삼중 세포 배양 BBB 모델 설정

1. pericyte 파종
   1. 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 세포 접착을 위해 활성화된 표면이 있는 T75 배양 플라스크에서 합류할 때까지 HBVP(Human brain vascular pericytes)를 배양합니다. 합류점에 도달하면 기존 pericyte 배지를 흡인하고 따뜻한 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 5mL로 세포를 세척합니다. 따뜻한 트립신-EDTA 용액 4mL와 DPBS.
      1mL의 조합을 사용하여 DPBS를 흡인하고 플라스크에서 세포를 분리합니다. 참고: P7 이후의 구절은 사용하지 마십시오.
   2. CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 5분 동안 플라스크를 배양합니다. 세포가 플라스크에서 분리되었는지 확인하기 위해 현미경으로 봅니다. 플라스크에 따뜻한 주피세포 배지 5mL(2% 소 태아 혈청[FBS] 함유)를 추가하고 분리된 세포를 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   3. 세포 현탁액을 200 ×g에서 3분 동안 원심분리하여 세포가 튜브 바닥에 펠릿을 형성하도록 합니다. 튜브에서 배지를 흡입하여 세포 펠릿이 손상되지 않도록 합니다.
   4. 세포 펠릿을 pericyte 배지에 재현탁시키고, 세포의 합류점과 필요한 웰 인서트의 수에 따라 배지의 양을 계산합니다. 재현 유탁 세포 10 μL를 취하여 세포 계수 슬라이드에 넣고 세포 수를 계수합니다.
   5. 세포 밀도를 측정하고 300,000 세포를 시드/1mL의 pericyte 배지에 웰 인서트(6-well 형식)의 abluminal side에 삽입합니다.
      메모: 인서트 아래쪽에 HBVP를 시딩할 때는 잘 삽입된 플레이트를 거꾸로 뒤집는 것이 중요합니다. 플레이트가 표면에 평평하게 놓여 있는 동안 바닥 부분을 제거하여 웰 인서트의 abluminal 면을 노출시킵니다. 증발을 방지하기 위해 abluminal 쪽에 pericyte cell suspension을 추가한 후 flipped plate로 well-inserts를 덮습니다. 37°C의 5% CO₂ 인큐베이터에서 모든 플레이트를 뒤집어 밤새 보관하십시오.
2. 성상세포(astrocyte) 파종
   1. 합류점에 도달할 때까지 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 T75 플라스크에서 HA(인간 성상세포)를 배양합니다. pericyte medium.
      대신 astrocyte medium(2% FBS 포함)을 사용하여 위의 단계 1.1.1-1.1.4를 따릅니다. 참고: P9 이후의 구절은 사용하지 마십시오.
   2. 세포 밀도를 측정하고 300,000 세포/웰을 조직 배양 6-well 플레이트의 바닥에 시딩합니다. 증발을 방지하기 위해 플레이트를 덮고 모든 플레이트를 5°C의 2% CO₃₇ 인큐베이터에 밤새 보관하십시오.
3. 내피 세포 파종
   1. HBMEC(Human brain microvascular endothelial cells)를 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터 내의 조직 배양 접시에서 합류할 때까지 배양합니다. 주피세포 배지 대신 완전한 클래식 배지(10% FBS 함유)를 사용하여 위의 1.1.1-1.1.4 단계를 따릅니다.
      메모: P12 이후의 구절은 사용하지 마십시오.
   2. 37°C의 5% CO₂ 인큐베이터에서 성상세포를 포함하는 조직 배양 6-well plate와 pericyte를 포함하는 well-inserts(6-well 형식)를 꺼냅니다.조직 배양 6-well plates에서 astrocyte medium을 흡인합니다. 각 웰에 1mL의 pericyte 배지와 1mL의 성상세포 배지를 추가합니다.
   3. 웰 삽입물에서 pericyte 배지를 흡인하고 seeded astrocyte를 포함하는 조직 배양 6-well plate에 배치합니다. 완전한 클래식 배지 2mL의 300,000 cells/well의 밀도로 HBMEC를 동일한 웰 인서트의 정점 면에 파종합니다.
      메모: 내피 세포는 웰 인서트의 abluminal 쪽에 pericyte를 파종하고 조직 배양 6-well plates에 성상세포를 파종한 후 다음 날 웰 인서트의 정점 쪽에 파종해야 합니다. 세포는 BBB와 같은 특성을 유도하기 위해 6일 동안 삼중 배양으로 유지되어야 합니다. 세포 배양 배지는 실험 24시간 전에 두 웰 인서트 컴파트먼트에서 교체해야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
24mm 트랜스웰과 0.4μm 포어 폴리에스테르 멤브레인 인서트	코 닝	3450
35mm 유리 바닥 접시	MatTek 생명 과학(FISHERSCI)	P35GC-1.5-14-C
성상교세포 배지	사이언스 셀	1801
부착계수	세포 시스템(Fisher Scientific)	재질 보기 4Z0-201
세럼과 CultureBoost를 함유한 완벽한 클래식 미디엄	4Z0-500	세포 시스템
Corning 50 mL PP 원심분리기 튜브(CentriStar 캡이 있는 원뿔형 바닥	폭스바겐	430829
Corning 75cm² U자형 경사 목 처리되지 않은 세포 배양 플라스크	코 닝	431464U
Corning CellBIND 96웰 평면 투명 바닥 검은색 폴리스티렌 마이크로플레이트	코 닝	3340
Countes Cell Counting 챔버 슬라이드	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	C10228
Countess II FL 자동 세포 계수기	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	ZGEXSCCOUNTESS2FL
DMEM 배지 (포도당 없음, 글루타민 없음, 페놀 레드 없음)	써모피셔	A14430-01	포도당이 없는 배지
DPBS (칼슘 없음, 마그네슘 없음)	써모피셔	14190250
EBM 내피 세포 성장 기초 배지, 페놀 레드 프리, 500 mL	론자	CC-3129
CO2 인큐베이터
원심 분리기