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1. 젤라틴 메타크릴로일(GelMA)의 합성
- 돼지 껍질에서 얻은 젤라틴 10g의 무게를 달고 용액을 가열판에서 240rpm 및 50°C에서 완전히 용해될 때까지 저어주어 PBS 100mL에 용해합니다.
- 후드 아래에 낮은 수준의 기능화를 위해 2mL의 메타크릴 무수물(MA)을 첨가하고 젤라틴 에멀젼을 240rpm 및 50°C에서 2시간 동안 저어줍니다.
주의: MA 위험 문구: H302 + H332(삼키거나 흡입하면 유해함), H311(피부 접촉 시 독성), 314(심한 피부 화상 및 눈 손상 유발), 315(피부 자극 유발), H317(알레르기성 피부 반응을 일으킬 수 있음), H318(심각한 눈 손상 유발), 331(흡입 시 독성), H332(흡입 시 유해함), H335(호흡기 자극을 유발할 수 있음). 취급 지침: P261 (분진/흄/가스/미스트/증기/스프레이 흡입 피), P305 + P351 + P338 + P310 (눈에 들어간 경우: 몇 분 동안 물로 조심스럽게 헹굽니다. 콘택트렌즈가 있고 쉽게 할 수 있는 경우 제거합니다. 계속 헹굽니다. 즉시 독극물 센터/의사에게 연락하십시오), P301 + P312 + P330 (삼킨 경우: 몸이 좋지 않으면 독극물 센터/의사에게 연락하십시오. 입 헹궈내기).
메모: MA를 아주 천천히 한 방울 한 방울 추가하십시오.
- 젤라틴-MA 용액을 예열된 PBS(50°C) 100mL에 희석하여 최종 부피 200mL를 얻고 용액을 240rpm 및 50°C에서 10분 동안 교반합니다.
- 투석막(분자 차단 12-14kDa)을 ~20cm로 자르고 부드러워질 때까지 탈이온수에 담급니다.
메모: 구멍이나 결함이 없는지 확인하기 위해 멤브레인에 탈이온수를 채웁니다.
- 깔때기를 사용하여 젤라틴-MA 용액을 멤브레인으로 옮깁니다.
메모: 혼합을 위해 내부에 여분의 공간을 남겨두고 양쪽을 닫습니다.
- 투석을 위해 젤라틴-MA 용액이 들어있는 멤브레인을 증류수 2L가 담긴 용기에 넣고 40°C에서 5일(500rpm) 동안 저어줍니다.
메모: 물이 증발하지 않도록 용기를 덮으십시오.
- 증류수를 하루에 두 번 교체하십시오. 매번 균질화를 위해 멤브레인을 거꾸로 뒤집습니다.
- 5일째 되는 날, 예열된 초순수 200mL(40°C)와 투석된 젤라틴-MA를 섞어 40°C에서 15분간 교반합니다.
- 젤라틴-MA 용액을 50mL 원뿔형 튜브에 최대 25mL까지 옮기고 튜브를 2일 동안 -80°C로 유지합니다.
메모: 동결 건조를 용이하게 하기 위해 튜브를 수평으로 보관하십시오.
- 냉동 용액을 3-5일 동안 동결건조하고 동결건조된 GelMA를 습기로부터 보호하여 보관합니다.
2. 바이오잉크 준비
참고: 1mL의 바이오잉크를 얻으려면 여과 중에 손실이 있을 수 있으므로 최소 3mL의 바이오 재료 용액을 제조하는 것이 좋습니다.
- 피브리노겐 용액의 제조
- 탈이온수에 식염수(NaCl 0.9%)를 준비하고 소 혈장에서 피브리노겐 10mg을 식염수 1mL에 용해시켜 10mg/mL의 농도를 얻습니다.
메모: 피브리노겐은 유리에 흡착되므로 유리 플라스크를 사용하여 피브리노겐 용액을 준비하지 마십시오.
- fibrinogen.
가 완전히 용해될 때까지 37°C에서 용액을 교반한 상태로 둡니다.
참고: 피브리노겐 용해의 경우 37°C의 오븐 내부에 배치된 회전 시스템을 사용하십시오. 37°C의 핫 플레이트에서 피브리노겐의 자기 교반(180rpm)도 적합합니다. 이 조건에서 10mg/mL 피브리노겐이 용해되는 데 약 40분이 걸립니다.
- 젤라틴/GelMA 용액의 제조
- 젤라틴 0.12g의 무게를 측정하고 예열된 PBS 1.9mL(40°C)에 첨가하여 최종 농도 4%(w/v) 젤라틴을 얻습니다. 용해를 용이하게 하는 와류.
- 에멀젼이 완전히 용해될 때까지 40°C로 유지하십시오.
- 동결건조된 GelMA 0.06g의 무게를 측정하고 젤라틴 용액에 옮겨 2%(w/v) GelMA의 최종 농도를 얻습니다. 용해를 용이하게 하는 와류.
- 완전히 용해될 때까지 용액을 40°C로 유지하십시오.
3. 성상세포가 함유된 젤라틴/GelMA/피브리노겐 바이오잉크의 제조
- 10mg/mL 피브리노겐 용액 0.9mL를 피펫팅하고 젤라틴/GelMA 용액으로 옮겨 최종 농도 3mg/mL의 피브리노겐을 얻습니다.
- 0.015g의 광개시제(PI)의 무게를 측정하고 젤라틴/GelMA/피브리노겐 용액으로 옮겨 0.5%(w/v) PI의 최종 농도를 얻습니다. 튜브를 위아래로 뒤집어 용액을 혼합하고 PI 저하를 방지하기 위해 빛으로부터 보호되는 40°C로 유지합니다.
메모: 최대 24시간 동안 4°C에서 바이오잉크를 비축합니다.
- 층류 아래에서 0.2μm 필터를 사용하여 용액을 멸균 15mL 원추형 튜브로 여과합니다.
메모: 생체 재료 용액은 여과가 가능하도록 37-40°C에 있어야 합니다.
- 980μL의 생체 재료 용액을 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
- 100μg/mL의 원액을 얻기 위해 식염수에 라미닌을 희석합니다.
- 20μL의 라미닌을 피펫팅하고 바이오잉크가 들어 있는 튜브로 옮겨 2μg/mL 라미닌의 최종 농도를 얻습니다.
- 거품이 생기지 않도록 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 기포가 지속되면 200 x g에서 2분 동안 원뿔형 튜브를 원심분리합니다. 바이오잉크가 세포와 혼합될 때까지 37°C로 유지하십시오.
- 0.05% 트립신으로 원발성 성상세포를 5분 동안 트립신화합니다.
메모: 1절부터 3절까지 성상세포를 사용합니다.
- FBS로 트립신 활성을 1:1 비율로 중화하고 세포를 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 200 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 세포를 세고 1 x 106 세포를 다른 원추형 튜브로 옮깁니다. 200 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 원뿔형 튜브의 바닥을 부드럽게 두드려 세포 펠릿을 현탁시키기 위해 작은 부피(~200μL)를 남기고 상층액을 제거합니다.
- 젤라틴/GelMA/피브리노겐 용액 1mL를 세포가 들어 있는 튜브에 옮기고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 균질화하여 1 x 106 cells/mL의 최종 농도를 얻습니다.
3. 가교제 용액의 준비
- 트롬빈 재구성
- 15mL 원추형 튜브에 0.1%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)이 포함된 멸균 탈이온수에 트롬빈 100U/mL의 원액 용액을 준비합니다. -20 °C.
의 마이크로튜브에 재고
참고: 트롬빈은 유리에 흡착되므로 유리 플라스크를 사용하여 원액을 준비하거나 부분 표본을 보관하지 마십시오.
- 트롬빈-CaCl2 용액의 제조
- 100μL의 트롬빈 원액을 피펫팅하고 8.9mL의 멸균 탈이온수가 들어 있는 50mL 코니컬 튜브로 옮겨 1U/mL 트롬빈의 최종 농도를 얻습니다.
- 탈이온수에 10%(w/v) CaCl2 용액을 준비하고 0.2μm 필터를 사용하여 멸균합니다.
- 1:9(CaCl2 대 트롬빈)의 최종 비율을 얻기 위해 10% CaCl2 용액 1.1mL를 트롬빈이 포함된 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
메모: 실험을 위해 부피에서 crosslinker 용액을 준비하고 보관을 피합니다.
4. 압출 기반 바이오프린터를 사용하여 성상세포가 함유된 바이오잉크를 바이오프린팅합니다.
- 신경 조직의 디자인
- G 코드 사용: X축과 Y축에서 각 바이오프린팅 라인 사이의 거리가 1mm이고 Z축에서 6개의 레이어(각 선 사이 0.2mm)의 거리를 가진 6 x 6mm(제곱 모양)의 그리드를 구성하고, 돌출(E)을 0.01mm로 설정하고 Z축의 새 레이어마다 0.001mm를 증가시키고, 인쇄 속도(F)를 400mm/min(추가 정보)으로 설정합니다.
- 바이오프린터 설정
- 기계를 자외선에 15분 동안 노출시킨 다음 에탄올 70%로 닦아냅니다.
- 전원 스위치를 사용하여 바이오프린터를 켭니다. USB 케이블을 통해 기기를 컴퓨터에 연결합니다. 제어 소프트웨어를 열어 바이오프린터에 연결하고 파일 디자인을 로드합니다.
- 바이오프린팅 주사기의 준비
- 1,000μL 피펫을 사용하여 성상세포가 함유된 젤라틴/GelMA/피브리노겐 바이오잉크를 5mL 플라스틱 주사기로 옮깁니다.
메모: 거품 형성을 피하기 위해 천천히 이동하십시오.
- 멸균 22G의 뭉툭한 바늘을 주사기에 연결합니다.
메모: 주사기를 4°C에서 2분 동안 그대로 둡니다.
- 주사기를 바이오프린터 프린트 헤드에 연결하고 바이오잉크를 수동으로 세척하여 남아 있는 기포를 제거합니다.
- 바이오프린팅
참고: 바이오프린팅은 층판 후드 외부에서 수행되었습니다.
- 바이오프린터 테이블에 35mm 배양 접시를 놓고 바늘이 움직일 수 있도록 바늘을 배양 접시 표면에서 0.1mm 떨어진 곳에 놓습니다.
참고: 각 바이오프린팅에 35mm 배양 접시 하나를 사용하십시오.
- 인쇄(Print) 버튼을 누릅니다.
- 바이오프린팅이 끝나면 주사기가 접시에서 멀어지는지 확인합니다. 그런 다음 배양 접시를 닫고 가교 과정을 준비합니다.
메모: 한 구조체의 바이오프린팅에는 약 1분 10초가 걸립니다.
- 바이오프린팅된 구조체와 배양을 가교
- GelMA 가교를 위해 배양 접시를 2mW/cm2의 자외선 아래에 2 x 60초(위아래) 동안 놓습니다.
- 층류 하에서 멸균 주걱을 사용하여 바이오프린팅된 구조체를 24웰 플레이트로 옮깁니다.
- 500μL의 트롬빈/CaCl2 용액을 추가하고 피브린 가교를 허용하기 위해 30분 동안 그대로 둡니다.
- 가교 용액을 제거하고 PBS 1x 2mL로 구축물을 세척합니다. 그런 다음 PBS를 1mL의 성상세포 배양 배지로 교체하고 37°C 및 5%CO2에서 배양합니다. 3일마다 매체를 교체하십시오.