교모세포종 세포의 3차원 배양을 위한 히알루론산 기반 하이드로겔

초록

출처: Xiao, W., et al. 환자 유래 교모세포종 세포의 3차원 배양을 위한 히알루론산 기반 하이드로겔. J. Vis. 특급 (2018).

이 동영상은 뇌종양에서 유래한 신경교종구(gliomasphere)가 어떻게 단세포로 분리되어 히알루론산 기반 하이드로겔에 캡슐화되는지 보여줍니다. 이 과정은 세포-세포 상호 작용을 촉진하여 구조화된 3차원 교모세포종 모델을 형성합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 히알루론산의 티올화

참고: 몰비는 달리 명시되지 않는 한 카르복실레이트 그룹의 총 수에 대해 명시됩니다.

1. 500mg의 히알루론산나트륨(HA, 500-750kDa)을 10mg/mL의 탈이온수 증류수(DiH_2O)를 멸균된 250mL 삼각 플라스크에 용해시킵니다. 용액(~200rpm)을 실온에서 2시간 동안 저어 HA가 완전히 녹도록 합니다. 티올화 절차 동안 반응이 계속 교반되도록 교반 막대와 자기 교반 플레이트를 사용하십시오.
2. 0.1M 염산(HCl)을 사용하여 HA 용액의 pH를 5.5로 조정합니다. 69.6-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC) 69.6mg(0.25x 몰비)의 무게를 잰다.
   메모: 용해되지 않은 EDC를 HA 용액에 직접 첨가할 수 있지만, 일반적으로 1mL의_DiH2O에 EDC를 먼저 용해한 다음 EDC 용액을 HA 용액에 빠르게 첨가하는 것이 더 쉽습니다. _DiH2O1mL에서의 사전 용해는 1.3 및 1.4 단계에서 반응에 첨가하기 전에 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 및 시스타민 디히드로콜로라이드로 수행할 수도 있습니다.
3. 반응에 NHS 17.9mg(몰 비율 0.125배)을 추가합니다. 0.1 M HCl을 사용하여 반응 용액의 pH를 5.5로 조정하고 실온에서 45분 동안 반응을 배양합니다.
4. 70.0 mg(0.25x 몰비)의 시스타민 디하이드로클로라이드를 반응 용액에 첨가합니다. 0.1M 수산화나트륨(NaOH)을 사용하여 pH를 6.25로 조정합니다. 교반하면서 실온에서 밤새 반응을 배양합니다.
5. 다음 날에는 1M NaOH를 사용하여 반응 용액의 pH를 약 8로 조정합니다. 192mg(4x 몰비)의 디티오트레이톨(DTT)을 반응에 추가합니다. DTT를 첨가한 후 pH를 다시 8로 조정하고 실온에서 1-2시간 동안 교반합니다.
6. 1M HCl을 사용하여 pH를 4로 조정합니다. 전체 반응 혼합물을 사전 담근 투석막(분자량 차단, 약 13kDa)으로 옮기고 pH 4.
   로 사전 조정된 DiH₂O에 대해 투석합니다. 메모: 투석을 위한_DiH2O의 부피는 반응된 HA 용액의 부피의 40배 이상이어야 합니다(예: _DiH2O, pH 4 2L의 50mL 샘플).
7. 투석 용액(DiH₂O, pH 4)을 실온에서 3일 동안 하루 2회 교체하십시오.
8. 투석된 용액을 0.22μm 멤브레인, 진공 구동 필터를 통해 여과합니다. 액체 질소에 있는 thiolated HA의 급속한 동결 해결책. 동결 건조기를 사용하여 건조 샘플을 2일 동안 동결합니다. 건조 형태의 티올화 HA는 -20°C의 진공 밀봉 건조기에 최소 6개월 동안 보관할 수 있습니다.
9. 티올화 정도를 확인하려면 Ellman의 테스트 및/또는 양성자 NMR 분광법을 사용하십시오.
    

2. 가교 재료 준비

1. 주변광에 대한 노출을 최소화하기 위해 호박색 바이알에 HEPES 완충 식염수(Hank's Balanced Salt Saline(HBSS) 완충액의 20mM HEPES, pH 8-9 이내로 조정됨)에 원하는 농도(이 예에서는 13.3mg/mL)로 티올 처리된 HA를 용해합니다. 용액을 계속 저어주세요.
   메모: HA에 접합된 티올 사이의 이황화 결합 형성은 pH가 8 이상이거나, 용액 농도가 너무 높거나, 용액이 겔화 전에 너무 오랫동안 교반된 경우 발생할 수 있습니다. 이 문제를 방지하려면 15mg/mL 미만의 티올화 HA를 사용하고 하이드로겔 형성 후 2시간 이내에 티올화 HA를 용해하십시오.
2. pH 7.4의 인산염 완충 식염수(PBS)에 4-arm-PEG-maleimide(PEG-Mal, 20kDa) 및 4-arm-PEG-thiol(PEG-thiol, 20kDa)을 용해시켜 50mg/mL PEG-Mal 및 PEG-thiol 스톡 용액을 준비합니다.
   메모: PEG 시약을 완전히 용해하는 데 최소 1시간이 걸립니다.
3. ECM 유래 펩타이드를 추가하는 경우 시스테인 함유 펩타이드를 PBS에 용해시켜 원액을 준비합니다.
   메모: 2-4mM의 스톡 농도를 사용하십시오.
4. 실리콘 고무 몰드를 에탄올에 최소 20분 동안 담궈 청소한 다음 멸균을 위해 오토클레이브합니다.

3. 하이드로겔 가교 및 세포 캡슐화

참고: 예를 들어, 0.5%(w/v) HA 및 1kPa의 압축 탄성률을 가진 4개의 개별 80μL 하이드로겔의 캡슐화가 설명되어 있습니다3. 예를 들어, 다양한 특성을 가진 하이드로겔을 생성하는 레시피: 인테그린 결합 펩타이드 RGD를 포함하는 2개의 하이드로겔과 펩타이드 활성에 대한 음성 대조군으로 시스테인 캡을 포함하는 2개의 하이드로겔을 참조하십시오. 환자 유래 교모세포종 세포의 시딩 농도는 500,000 cells/mL입니다.

1. 120μL PBS에 40μL의 원액을 첨가하여 PEG-Mal 원액(50mg/mL, 단계 2.2)을 12.5mg/mL로 희석합니다. 희석된 용액을 각각 80μL의 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브 2개로 분리합니다.
2. 16μL의 스톡 RGD 용액(2.8mM, 단계 2.3)을 하나의 튜브에 추가하고 16μL의 스톡 시스테인 용액(2.8mM, 단계 2.3)을 두 번째 튜브에 추가합니다. 섞는 소용돌이. 3.9.
   단계에서 사용할 때까지 PEG-Mal-RGD 또는 PEG-Mal-CYS 용액을 얼음 위에 놓습니다. 메모: 여기에 설명된 절차는 ~140μM의 펩타이드를 함유한 하이드로겔을 생성합니다. 이는 사용 가능한 PEG 팔 8개 중 약 1개가 펩타이드로 채워져 있는 것과 같습니다. 이는 시스테인 말단 펩타이드의 몰 비율을 사용 가능한 말레이미드 그룹에 변경함으로써 달라질 수 있습니다. 일반적으로 최대 280μM의 펩타이드 농도를 달성하면서 하이드로겔 교차결합에 사용할 수 있는 충분한 수의 maleimide 그룹을 유지할 수 있습니다.
3. 4μL의 50mg/mL 원액과 36μL의 PBS를 혼합하여 PEG-티올 원액(50mg/mL, 단계 2.2)을 5mg/mL로 희석합니다. 2.1단계에서 용해된 티올화된 HA 120μL를 혼합물에 추가합니다.
   메모: HMW HA의 솔루션은 점성이 매우 높습니다. 따라서 용액을 전달하기 위해 넓은 오리피스 마이크로피펫 팁을 사용하는 것이 좋습니다. 용액이 마이크로피펫 팁의 벽에 달라붙는 것을 방지하고 측정 정확도를 향상시키기 위해 천천히 피펫을 피펫합니다.
4. 깨끗하고 건조한 주형(2.4단계에서 준비)을 비조직 배양 처리된 12웰 플레이트의 각 웰에 넣습니다. 피펫 팁의 깨끗하고 뭉툭한 끝을 사용하여 젤 몰드를 누르고 몰드와 웰 플레이트의 바닥 사이의 밀봉을 다시 확인합니다.
   메모: 누출을 방지하기 위해 캡슐화 직전에 씰을 다시 확인하십시오.
5. 계대 배양된 GBM 세포는 단일 세포로 해리되고 앞서 설명한 바와 같이 세포 농도를 측정합니다3.
   메모: 일부 교모세포종 세포는 단일 세포로 해리될 수 없습니다. 이 경우 전체 신경교구를 캡슐화할 수 있습니다. 그러나 재현성을 개선하기 위해 정확한 세포 계수 후 해리된 단일 세포를 준비합니다. 신경교구 통과를 위한 프로토콜은 실험실마다 다르며, 이들 중 다수는 하이드로겔 캡슐화와 호환될 가능성이 높습니다.
   1. (권장) 500 x g에서 5분 동안 신경교세포를 원심분리하여 상층액을 제거하고 세포 펠렛에 세포 해리 효소 1mL를 추가합니다. 그런 다음 5분 동안 배양하면서 튜브를 부드럽게 두드려 저어줍니다.
   2. 4mL의 완전 배양 배지(50ng/mL EGF, 20ng/mL FGF-2, 25μg/mL 헤파린, G21 보충제 및 DMEM/F12의 1% 페니실린/스트렙토마이신)를 세포에 추가합니다.
   3. 500 x g에서 5분 동안 다시 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다. 마지막으로, 전체 배지 1mL에 세포 펠릿을 재현탁하고 70μm 세포 스트레이너에 부유 세포를 통과시킵니다. (권장) 회수되는 세포 수를 최대화하기 위해 추가로 4mL의 전체 배지로 스트레이너를 세척합니다.
6. 혈구계(hemocyometer)를 사용하여 현탁액에 있는 세포의 농도를 추정합니다. 세포 현탁액을 2개의 원심분리 튜브로 분할하며, 각 튜브에는 ~80,000개의 세포가 들어 있습니다. 500 x g에서 5분 동안 원심분리기; 일반적으로 80,000개의 세포가 2개의 80μL 하이드로겔을 구성합니다.
7. 상층액을 제거하고 펠릿 1개를 80μL의 PEG-MAL-RGD 용액에 재현탁시키고 두 번째 펠릿을 80μL의 PEG-MAL-CYS 용액에 재현탁합니다(3.1단계에서 준비).
8. 200μL의 넓은 오리피스 마이크로피펫 팁을 사용하여 40μL의 HA 용액(위 3.3단계)을 각 고무 실리콘 몰드(3.4단계에서 준비한 대로)에 분배합니다.
9. 200μL의 넓은 오리피스 마이크로피펫 팁을 사용하여 40μL의 PEG-MAL-CYS 또는 PEG-MAL-RGD 셀 용액을 금형의 HA 용액과 혼합합니다. 피펫은 10 번 이상 빠르게 위아래로 움직입니다. 준비 중인 각 겔 배양에 대해 반복합니다.
   메모: 이 단계는 초기 겔화가 빠르게(30초 이내) 발생하기 때문에 연습이 필요합니다. 균일한 혼합을 보장하기 위해 팁을 금형의 다른 위치로 이동하면서 위아래로 피펫팅합니다. 기포가 형성되지 않도록 항상 팁을 액체 수준 이하로 유지하십시오. 마이크로피펫 팁 내부에 젤이 형성될 수 있으므로 용액을 너무 많이 혼합하지 마십시오. PEG-MAL-CYS 및 PEG-MAL-RGD는 원하는 RGD 펩타이드 농도를 달성하기 위해 다양한 비율로 결합할 수 있습니다.
10. 겔로 캡슐화된 세포가 포함된 웰 플레이트를 37°C 세포 배양 인큐베이터에 5-10분 동안 넣어 반응이 완료되도록 합니다.
11. 형성된 겔과 함께 각 웰에 2-2.5mL의 배양 배지를 추가합니다. 멸균된 2μL 피펫 팁 또는 마이크로 주걱을 사용하여 금형과 젤을 부드럽게 분리합니다. 사전 멸균된 집게를 사용하여 웰 플레이트에서 곰팡이를 제거합니다. 배양 및 향후 실험을 위해 웰 플레이트를 세포 인큐베이터(37°C 및 5%CO₂)에 다시 놓습니다.
    메모: 젤 배양액에 해를 끼치지 않도록 금형을 수직으로 위로 당깁니다. 일반적으로 겔 배양액의 배지는 3-4일마다 교체해야 합니다. 매체를 제거할 때 하이드로겔을 흡입하지 않도록 주의하십시오. 이것이 문제인 경우 플라스틱 이송 피펫을 사용하는 것이 좋습니다. 세포 수를 추적하기 위한 생물발광 이미징을 계획하고 있는 경우, 앞서 설명한 바와 같이 캡슐화 전에 구조적으로 루시퍼라아제 발현을 렌티바이러스 인코딩으로 교모세포종 세포에 transduction해야 합니다3. 생물 발광 이미징의 경우, 발광 이미징 1시간 전에 배양 배지에 1mM의 D-루시페린을 첨가합니다.

결과

표 1. 하이드로겔 제형은 HA 농도 및 기계적 특성을 독립적으로 제어합니다.

...

젤 유형	파트 A(각 40μL)			파트 B(각 40μL)
	4암-페그-말(50mg/mL)	시스테인 또는 RGD(2.81mM)	PBS(산도 7.4)	4Arm-PEG-티올 (50mg/mL)

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
pH 측정기	써모 피셔	해당 사항 없음	pH 2-10 감도가 있는 모든 pH 측정기
교반 플레이트	써모 피셔	해당 사항 없음	일반 실험실 장비
삼각 플라스크 (125mL)	써모 피셔	FB-501-125 (영문
2L 폴리프로필렌 비커	써모 피셔	S01916
히알루론나트륨	라이프코어	하700K-5	500-750 kDa 범위
1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC)	써모 피셔	파이-22980
N-하이드록시숙신이미드(NHS)	시그마 알드리치	130672-5지
염산(HCl)	써모 피셔	SA48-500
수산화나트륨(NaOH)	써모 피셔	SS266-1 (영어
시스타민 디하이드로클로라이드	써모 피셔	AC111770250
디티올트레이톨(DTT)	써모 피셔	BP172-25
Ellman의 테스트 시약(5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid	시그마 알드리치	D218200-1지
중수소수(산화중수소)	써모 피셔	AC166301000
0.22μm 진공 구동 필터	셀트리트	229706
인산염 완충 식염수(PBS)	써모 피셔	P32080-100티
행크스의 균형 잡힌 소금 식염수(HBSS)	써모 피셔	MT-21-022-CV
4 팔 나무못 maleimide	JenKem 기술	A7029-1	분자량: 약 20kDa
4 팔 나무못 티올	JenKem 기술	A7039-1	분자량: 약 20kDa
L-시스테인	시그마 알드리치	C7880-100G
RGD ECM 모방 펩타이드	진스크립트 바이오테크	해당 사항 없음	"GCGYGRGDSPG" 서열을 가진 맞춤형 펩타이드, N-말단은 아세틸화되어야 합니다
실리콘 몰드	시그마 알드리치	GBL664201-25개	면도날을 사용하여 한 조각으로 자릅니다
완전한 문화 매체	다양한	다양한	비혈청 보충제(GeminiBio의 G21)를 사용한 DMEM/F12(Thermofisher), 표피 성장 인자 50ng/mL(Peprotech), 섬유아세포 성장 인자 20ng/mL(Pepro Tech) 및 헤프라인 25μg/mL(Sigma Aldrich), 배양 배지는 실험실마다 다릅니다.
환자 유래 교모세포종 세포	해당 사항 없음	해당 사항 없음
프로테아제/포스파타제 억제제 미니 정제	시그마 알드리치	5892970001
TrypLE 익스프레스	써모 피셔	12604013
70μm 세포 스트레이너	써모 피셔	Tel.: 22-363-548
세포 배양 인큐베이터	써모 피셔	해당 사항 없음	5% CO2 및 37C의 모든 일반
냉장고/냉동고	써모 피셔	해당 사항 없음	-20C 및 -80C 용량의 모든 일반 실험실 장비
일회용 임베딩 금형	써모 피셔	12-20
넓은 오리피스 피펫 팁	써모 피셔	9405120

) ) . . 년