유기형 소뇌 절편 배양에서 Purkinje 세포 생존 분석

초록

출처: Rakotomamonjy, J., et al. Purkinje 세포 생존 유기형 소뇌 절편 배양에서. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오는 쥐 강아지의 뇌에서 소뇌 유기형 절편을 채취하여 영양소와 성장 인자로 보충된 배지에서 절편을 배양하여 체외에서 소뇌 발달을 모방하는 기술을 보여줍니다.또한 특정 소뇌 절편을 테스트 화합물로 처리하고 면역형광 염색 기술을 사용하여 화합물의 신경 보호 능력을 분석합니다.

프로토콜

1. 유기형 소뇌 절편 배양 전 준비

사전에
1. 70% 에탄올을 분사한 세포 배양 후드에서 멸균 병 리퀴드에 부착된 250mL 보틀탑 진공 필터에 200mL의 배양 배지를 준비합니다. BME(Basal Medium Eagle) 100mL, HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution) 50mL, 열 비활성화 호스 세럼 50mL, 200mM L-글루타민 1mL(최종 농도 1mM) 및 200g/L 포도당 5mL(최종 농도 5mg/mL)를 추가합니다. 배양 배지를 진공 여과하고 최대 한 달 동안 +4 °C로 유지합니다.
2. 멸균된 생물 안전 캐비닛에서 포장에서 6웰 배양 플레이트를 꺼냅니다. 각 웰에 1mL의 배양 배지를 채웁니다. 치료가 시험되는 경우에, 대우한 우물에 약리학적인 대리인을 추가하고, 대조군 우물을 위한 차량 해결책의 동일한 양을 추가하십시오. 본 연구에서는 처리된 웰(30mM 최종)에 1μL의 멸균 3M KCl 용액을 첨가하고 대조 웰에 1μL의 멸균수를 첨가했습니다.
3. 친수성 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 멤브레인(공극 크기 = 0.4μm)이 있는 개별 포장된 세포 배양 삽입물을 필요한 수의 세포 배양 후드 내부로 가져옵니다. 조심스럽게 포장을 풀고 멸균 집게로 세포 배양 삽입물을 꺼냅니다. 6웰 플레이트의 웰에 하나씩 떨어뜨려 삽입 멤브레인과 세포 배양 배지 사이의 계면에서 기포가 생기지 않도록 합니다. 배양 전 최소 2시간 동안 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터의 배지에서 인서트를 평형화합니다.
   메모: 조직 다지기는 세포 배양 후드에 영구적으로 상주합니다.
4. 200mL 비커 2개를 준비하되, 하나는 150mL 멸균수로, 다른 하나는 150mL 70% 에탄올로 채웁니다. 수술 도구를 70% 에탄올 욕조에 담근 다음 사용하기 전에 물에 담그십시오.
   메모: 에탄올과 접촉한 직후 수술 도구를 사용하지 마십시오.
5. 70% 에탄올 비커의 양날 칼날을 소독합니다. 멸균 집게를 사용하여 블레이드 홀더에 놓고 블레이드 cl을 사용하여 제자리에 고정합니다.amp 렌치. 사용할 때까지 말리십시오.
6. 70% 에탄올 비커에 티슈 다지기와 함께 제공된 플라스틱 디스크를 소독합니다. 디스크를 놓기 전에 절단 테이블에 70% 에탄올을 뿌립니다. 사용할 때까지 말리십시오.

2. 해부와 소뇌 유기형 슬라이스 배양

1. 새끼 쥐를 세포 배양 후드 안으로 가져와 해부를 수행합니다.
2. 곧은 작동 가위를 사용하여 강아지의 목을 빠르게 잘라냅니다(그림 1A).
3. 스트레이트 드레싱 집게로 강아지의 머리를 코로 잡고 곧은 눈 가위를 사용하여 뒤쪽 끝에서 시작하여 측면으로 정중선으로 두피를 자릅니다.
4. 두개골에 대해서도 동일하게 진행하십시오.
   메모: 해부 중 소뇌가 손상되지 않도록 가위 끝을 바깥쪽으로 향하게 하십시오.
5. 뇌를 꺼내 차가운 HBSS + 5mg/mL 포도당으로 채워진 60mm 접시에 옮깁니다.
6. 멸균된 곧고 가는 집게를 사용하여 소뇌를 조심스럽게 절개합니다(그림 1B). 멸균 곡선의 미세한 집게를 사용하여 티슈 다지기의 절단 테이블에 놓인 플라스틱 디스크로 옮깁니다.
7. 절단 테이블을 회전하여 조직의 방향을 지정하여 시상 단면을 수행합니다.
8. 테이블 분리 손잡이를 오른쪽으로 당겨 절단 테이블을 이동하여 날이 티슈 가장자리에 위치하도록 합니다.
9. 슬라이스 두께를 350μm로 조정하고 블레이드 속도를 중간으로 조정합니다.
10. 헬리콥터를 시작합니다. 소뇌 전체를 자르면(그림 1C) 헬리콥터를 끕니다.
11. 멸균 집게로 플라스틱 디스크를 제거합니다.
12. HBSS + 60mg/mL 포도당이 들어 있는 5mm 접시에 플라스틱 디스크를 조심스럽게 가까이 가져옵니다. 멸균 전사 피펫을 사용하여 HBSS + 5mg/mL 포도당을 조직에 차갑게 피펫으로 넣어 완충액이 채워진 접시에서 소뇌 절편을 수확할 수 있습니다.
13. 마이크로프로브를 사용하여 소뇌 절편을 서로 분리합니다. 전사 피펫으로 양질의 절편을 꺼내고(해충에 가까운 조직 절편을 사용하는 것이 좋음) 사전 평형 세포 배양 삽입물에 넣습니다(그림 1D).
14. 마이크로프로브를 사용하여 세포 배양 삽입물에 소뇌 절편을 배치한 다음 전사 피펫으로 여분의 HBSS + 5mg/mL 포도당 용액을 조심스럽게 제거합니다.
    메모: 이 단계에서 조직은 매우 부드럽고 물리적 손상이 발생하기 쉽습니다. 세포 배양 삽입물당 소뇌 절편의 최대 수는 기증자 동물의 나이에 따라 다릅니다. P0-P4 나이 동물의 경우 6-8 조각, P5 이상 동물의 경우 4-6 조각을 배양 할 수 있습니다.
15. 배양 접시를 인큐베이터에 넣고 2-3일마다 배지를 완전히 교체합니다.
16. Purkinje 세포 생존을 평가하기 위해 시험관 내에서 빠르면 5일 이내에 절편을 수집할 수 있습니다. 다른 목적을 위해 몇 주 동안 배양에서 유지할 수 있습니다(그림 1F).
    메모: Purkinje 세포 생존 실험의 경우 세포 배양 배지를 변경할 때 약리학적 치료를 갱신할 필요가 없습니다(그림 1F).

3. 면역형광

1. 인큐베이터에서 6웰 플레이트를 꺼냅니다. 세포 배양 배지를 제거하고 세포 배양 인서트를 1x PBS로 세척한 후 세포 배양 인서트 아래에 1mL, 세포 배양 인서트 위에 500μL를 놓고 차가운 4% 파라포름알데히드 용액으로 슬라이스를 1시간 동안 고정합니다.
2. 오비탈 쉐이커에서 1x PBS로 인서트를 4x 10분 동안 세척하고, 인서트 상단에 1mL 이하, 500μL
를 사용하여 세척합니다.
3. 브러시를 사용하여 1개의 세포 배양 삽입물에서 소뇌 절편을 1x PBS, 0.25% Triton X-100 및 3% BSA(PBS-TB), 500μL/웰로 미리 채워진 24웰의 1웰로 옮깁니다.
4. 실온에서 1시간 동안 PBS-TB에서 배양하여 슬라이스를 투과하고 차단합니다.
5. PBS-TB 용액에 희석된 1차 항체를 사용하여 하룻밤 + 4°C에서 200μL/웰의 오비탈 쉐이커에서 배양합니다.
6. 다음 날, 500μL/웰의 오비탈 셰이커에서 1x PBS로 10분씩 4회 세척합니다.
7. PBS-TB 용액에 희석된 2차 항체를 실온에서 2시간 동안 오비탈 쉐이커에서 200μL/well의 빛으로부터 보호하여 배양합니다.
8. 500μL/웰의 오비탈 셰이커에서 1x PBS로 10분씩 4회 세척합니다.
9. 1x PBS(2μg/mL)에 희석한 Hoechst 33342를 사용하여 500μL/well의 빛으로부터 보호되는 실온에서 10분 동안 슬라이스를 카운터 염색합니다.
10. 소뇌 절편을 전사 피펫으로 현미경 슬라이드에 장착합니다. 빛으로부터 보호하여 완전히 자연 건조시키십시오. 1x PBS로 재가습하고 몇 방울의 장착 매체(~80μL)로 덮인 커버슬립을 적용합니다. 거품을 만들지 마십시오.
11. 장착 매체가 경화되면 소뇌 부분을 이미지화할 준비가 됩니다.

4. 세포 생존의 이미징 및 정량화

1. 제조업체에 따라 현미경과 레이저를 켭니다.
2. 수집 소프트웨어를 시작합니다.
3. 10X 대물렌즈를 사용하여 9-10개의 소엽(일반적으로 vermis에 가까운 소뇌 부분)이 있는 변경되지 않은 소뇌 절편을 찾습니다.
4. z-stack 획득을 활성화합니다. 소뇌 절편에 존재하는 모든 Purkinje 세포를 포함하도록 z-스택의 범위를 정의합니다. 2μm 스텝 크기를 설정하고 획득을 시작합니다. 수집된 사진을 획득 소프트웨어 제조업체의 형식으로 저장하여 관련 메타데이터를 보존합니다.
5. Bio-formats 플러그인을 사용하여 ImageJ에서 획득한 파일을 엽니다.
6. Image > Stacks > Z-project...(그림 2A)로 이동합니다.
7. Projection type 드롭다운 메뉴에서 Max Intensity를 선택하고 OK(확인)를 클릭합니다(그림 2B).
8. 평면화된 2D 이미지가 생성됩니다. Multi-point 도구를 두 번 클릭하여 Point Tool 창을 표시합니다. 선택 취소 Label points 계산된 셀 시각화를 용이하게 하는 옵션을 선택합니다. 그런 다음 Purkinje 세포의 솜을 직접 클릭하여 계산을 시작합니다(그림 1E). 계수된 셀의 총 수는 Point Tool 창의 아래쪽에 표시됩니다(그림 3).
   메모: 일반적으로 세포 배양 삽입체당 9-10개의 소엽을 포함하는 최소 3개의 손상되지 않은 절편을 정량화할 수 있습니다. 약리제의 신경 보호 효과를 평가하려면 최소 3개의 독립적인 실험을 수행해야 합니다.

결과

그림 1: 해부에서 Purkinje 세포 생존 정량화까지의 프로토콜 그림. 새끼 쥐는 빠르게 목이 잘립니다(A). 뇌 해부 후 소뇌를 분리한 다음(B) 350μm 너비의 절편(C)으로 잘게 자릅니다. 소뇌 절편을 대조군 또는 처리된 세포 배양 삽입물(D)에 놓고 시험관에서 최소 5일 동안 배양으로 유지합니다. 그런 다음 조직을 4% 파라포름알데히드에 고정하고 면역 염색을 수행한 다음 컨포칼 현미경으로 사진을 획득합니다. 마지막으로, Purkinje 세포 수는 ImageJ(E)의 Multipoint Tool을 사용하여 각 슬라이스에서 정량화됩니다. (F)

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Alexa Fluor 594 당나귀 항-마우스 IgG 2차 항체	ThermoFisher 사이언티픽	A21203
기저 미디엄 이글(BME)	ThermoFisher 사이언티픽	21010046
생물안전 작업대 Class II, Type A2	누아이레	NU-540-400
소 혈청 알부민	밀리포어 시그마	A2153
브러시
Anti-Calbindin D-28K 항체 (CB-955)	아브캠	AB82812
CO2 인큐베이터	누아이레	NU-5700
Corning Costar Flat Bottom 6웰 세포 배양 플레이트	피셔 사이언티픽	07-200-83
커버슬립, 22 x 50 mm	피셔 사이언티픽	12-545-E
드레싱 겸자, 스트레이트	하버드 기구	Tel.: 72-8949
양날 칼날	피셔 사이언티픽	50949411
에탄올 200 증거	디콘 랩스, Inc	2701
눈 가위, 스트레이트	하버드 기구	Tel.: 72-8428
가는 집게	피셔 사이언티픽	16-100-127
L-글루타민 100X	ThermoFisher 사이언티픽	25030149
포도당 용액	ThermoFisher 사이언티픽	A2494001
행크스의 균형 잡힌 소금 솔루션	ThermoFisher 사이언티픽	14025092
Hoechst 33342, 트리하이드로클로라이드, 트리하이드레이트	피셔 사이언티픽	H21492 (영문
말 혈청, 불활성화, 뉴질랜드 원산지	ThermoFisher 사이언티픽	26050088
이미지J
McIlwain 조직 초퍼	피셔 사이언티픽	NC9914528
마이크로프로브	피셔 사이언티픽	제08-850
밀리셀 세포 배양 인서트	밀리포어 시그마	PICM0RG50
Nalgene Rapid-Flow 멸균 일회용 필터 장치(PES 멤브레인 포함), 250 mL	ThermoFisher 사이언티픽	Tel.: 168-0045
Nikon A1R 컨포칼 레이저 현미경 시스템	니콘
NIS-Elements 이미징 소프트웨어	니콘
파라포름알데히드	아크로스 오가닉스	제41678-0010
파스퇴르 피펫	피셔 사이언티픽	13-678-20디
염화칼륨	피셔 사이언티픽	BP366-500
ProLong 골드 안티페이드 마운턴트	ThermoFisher 사이언티픽	P10144
작동 가위, 스트레이트	하버드 기구	Tel.: 72-8403
오비탈 쉐이커벨리 댄서	IBI 사이언티픽	BDRLS0003
프리즘 8	그래프패드
Superfrost Plus 현미경 슬라이드	피셔 사이언티픽	제12-550-15
조직 배양 접시, 60mm(그립 링 포함	피셔 사이언티픽	FB012921
조직 배양 플레이트, 24웰	팔콘/코닝	353047
이송 피펫, sterile	ThermoFisher 사이언티픽	제13-711-21
트리톤 X-100	ThermoFisher 사이언티픽	BP151-500

년 ) 호 호 (영문) 호 ) 호