출처: Servello, D. et al., 중추신경 축삭돌기의 정맥류 형성 및 회복을 연구하기 위한 미생물역학 시스템. J. Vis. 특급. (2018).
이 비디오는 효소 및 기계적 해리를 사용하여 해마 조직 샘플에서 해마 뉴런의 해리 및 배양을 보여줍니다. Ara-C를 사용한 치료는 비신경 세포의 성장을 억제하여 해마 뉴런의 선택적 성장을 촉진합니다.
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방법 논문
Dissociating and Culturing Neurons from Hippocampal Tissue Samples(해마 조직 샘플에서 뉴런 분리와 배양)
1K 조회수
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2025년 7월 8일
이 논문에서
초록
프로토콜
검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 임신한 쥐/쥐의 해마 뉴런의 해부, 해리 및 배양
- 배양을 위한 해마 뉴런의 해부 및 해리
- 프로테아제 효소 용액(슬라이스 해부 용액의 3mg/mL 프로테아제 23, SLDS, 표 1) 및 37°C에서 예열 도금 매체(표 2)를 예열합니다.
- 해마를 절개하고 SLDS.
로 헹굽니다. 메모: 4개의 해마는 1개의 24웰 또는 1개의 6웰 플레이트에 충분한 세포를 제공합니다. - SLDS를 제거하고 프로테아제 효소 용액 2mL를 첨가한 후 샘플을 37°C, 5% CO2에서 15분 동안 배양합니다.
- 해마 외식식물을 5-10mL의 도금 배지로 두 번 세척합니다. 도금 매체 5mL를 추가합니다. 1mL 플라스틱 팁이 있는 피펫을 사용하여 작은 와류를 생성하여 해마 외식을 단일 세포로 해리합니다. 용액이 흐려지고 큰 외식 조각이 남지 않을 때까지 산소 기포 형성을 피하면서 약 40회 위아래로 피펫팅합니다.
메모: 씻는 동안 일부 매체를 남겨 두는 것을 잊지 마십시오, 해마 외식은 전체 과정 동안 매체에 잠겨 있어야합니다. - 1,125 x g에서 3분 동안 세포를 원심분리하고 세포가 배지에 잠긴 상층액을 제거합니다. 145mL의 도금 매체에 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액 1mL/웰을 24웰 플레이트에 추가합니다(3mL/웰을 6웰 플레이트에 첨가).
참고: 145mL의 도금 매체는 세포 밀도가 낮은 세포 현탁액을 생산하는 데 사용됩니다. 이 부피를 통해 수행할 실험에 따라 세포를 6개의 24웰 플레이트, 8개의 6웰 플레이트 또는 24웰 또는 6웰 플레이트의 다양한 조합으로 도금할 수 있습니다. 24웰 플레이트의 각 웰에는 약 3 x 104개의 셀이 있습니다. - 37 ° C, 5 % CO2에서 2-4 시간 동안 도금 매체의 세포를 배양 한 다음 모든 도금 매체를 제거하고 새로운 유지 관리 매체로 교체하십시오.
- 2일(시험관 내 2일, 2DIV) 후 배지의 절반을 유지 배지에 용해된 2μM Ara-C(아라비노실시토신)로 교체하여 섬유아세포, 내피 및 신경교세포의 성장을 억제합니다. 세포를 Ara-C에 2일 동안 노출시킨 후 배지를 새 유지 관리 배지로 교체합니다.
표 1: 커버슬립 코팅 용액. 배양된 세포를 커버슬립에 부착하는 데 사용되는 커버슬립 코팅 용액을 준비하기 위한 레시피를 제공합니다.
| 커버슬립 코팅 솔루션 | |
| 780 마이크로L | 아세트산17 mM 스톡: H2O 50 mL 중 50 μL 아세트산 |
| 200 마이크로L | Poly-D-lysine(0.5mg/mL 재고) |
| 20 마이크로L | 쥐꼬리 콜라겐 (3 mg/mL 스톡) |
| 총 부피는 코팅할 커버슬립의 수에 따라 결정됩니다. | |
표 2: 세포 배양 배지 레시피.1차 해마 뉴런 세포의 배양에 사용되는 배지를 준비하기 위한 레시피를 제공합니다.
리터 표시기| 1x 슬라이스 해부 용액(SLDS), 여과, pH= 7.4, 4°C에서 보관 | |
| 1 | ddH2O |
| 82 밀리미터 | 나2그래서4 |
| 30 밀리미터. | 케이2그래서4 |
| 10 밀리미터미터 | HEPES (유리 산) |
| 10 밀리미터미터 | D-포도당 |
| 5 밀리미터미터 | 재질 보기 MgCl2 |
| 0.00% | 페놀 레드(선택 사항) |
| 도금 매체 (PM, 필터, 4 °C에서 보관) | |
| 439 밀리리터 | MEM 얼스 솔트 |
| 50 밀리리터 | FBS(증권 시세 |
| 11.25 밀리리터 | D-포도당 20% |
| 5 밀리리터 | 나트륨 피루브산 (100 mM,) |
| 62.5 μL | L-글루타민(200mM) |
| 5 밀리리터 | 페니실린/스트렙토마이신 (P/S, 100x) |
| 유지 보수 매체 (MM, 필터, 4 °C에서 보관) | |
| 484 밀리리터 | 뉴로기저 |
| 10 밀리리터 | B27 50x 보충제 |
| 1.25 밀리리터 | L-글루타민(200mM) |
| 5 밀리리터 | 100배 P/초 |
| 모든 용액은 0.2mm 기공 크기의 필터를 사용하여 멸균됩니다. | |
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공개 사항
선언된 이해 상충이 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 12mm 커버슬립 | 워너 인스트루먼트 | 우편번호 64-0702 | 24웰 플레이트용 |
| 25mm 커버슬립 | 피셔 사이언티픽 | Tel.: 12-545-102 | 6웰 플레이트용 |
| 아세트산 | 피셔 사이언티픽 | 대답 38-212 | |
| 폴리-D-라이신 | 시그마 | P6407 | |
| 쥐 꼬리 콜라겐 | 로슈 | 번호 11호 179 179 001 | |
| 10X PBS | 국가진단학(National Diagnostics | CL-253 | |
| 나2이렇게4 | 피셔 사이언티픽 | S373-500 | |
| K2이렇게4 | 피셔 사이언티픽 | P304-500 | |
| 헤페스 | 피셔 사이언티픽 | BP410-500 | |
| D-포도당 | 피셔 사이언티픽 | D16-500 | |
| 마그네슘Cl2 | 피셔 사이언티픽 | BP214-500 | |
| 나오 | 피셔 사이언티픽 | SS255-1 (영어 | |
| 프로테아제 효소 | 시그마 | P4032 | |
| FBS(증권 시세 | 지브코 | 26140 | |
| 나트륨 피루브산 | 지브코 | 제11360-070 | |
| L-글루타민 | 지브코 | 25030081 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 100배(P/S) | 지브코 | 15140122 | |
| MEM 얼스 솔트 | 지브코 | 11090 | |
| B27 보충제 | 지브코 | 제17504-044 | |
| 뉴로기저 | 지브코 | 제21103-049 | |
| 아라비노실시토신(Ara-C) | 시그마 | 147-94-4 | |
| Opti-MEM 매체 | 지브코 | 31985-070 |
