인간 배아 줄기 세포를 희소돌기아교세포로 분화

초록

출처: Assetta, B., et al. 뉴런-희소돌기아교세포 상호작용 모델링을 위한 만능 줄기세포에서 인간 뉴런 및 희소돌기아교세포의 생성. J. Vis. 특급 (2020).

이 동영상은 인간 배아 줄기 세포에서 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)를 생성한 후 OPC가 희소돌기아교세포로 성숙하는 과정을 보여줍니다. 이러한 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)를 생성하는 과정은 알츠하이머병을 포함한 신경퇴행성 질환의 연구와 치료를 개선할 수 있는 수많은 길을 열어줍니다.

프로토콜

1. 만능 줄기 세포와 희소돌기아교세포 성숙에서 인간 희소돌기아교세포 전구세포(OPC) 유도

1. NPC(Neural Progenitor Cell) 생성: 단층 프로토콜(~7일). 흐름도는 그림 1A를 참조하십시오.
   1. 52의 통로에서 시판되는 H1 인간 ES 세포를 사용합니다(재료 표 참조). ES 세포 유지 배지(재료 표 참조)를 사용하여 세포외 기질 용액으로 코팅된 6-well 플레이트(6-well 플레이트당 ~0.5mg의 매트릭스 용액, 재료 표 참조)에서 세포를 배양하고 37°C에서 5% CO₂로 플레이트를 배양합니다.
   2. 이중 SMADi라는 확립된 접근 방식을 통해 세포를 신경 전구 세포(NPC)로 트랜스 분화하며, 여러 신호 경로를 위한 소분자 억제제를 사용합니다. 여기에서는 널리 사용되는 상용 키트를 사용하고 제조업체에서 제공하는 단층 프로토콜을 따릅니다(재료 표 참조).
   3. Day -1에서, 배아 줄기(ES) 세포 유지 배지(Table of Materials)가 있는 성장 인자 감소 매트릭스 용액(재료 표 참조; 6-웰 플레이트당 ~0.5 mg의 매트릭스 용액)으로 코팅된 6-well 플레이트의 플레이트 0.5–1 x 10^{웰당 6}개 세포. 이 성장 인자 감소 매트릭스 용액은 다음 단계에서 사용될 모든 플레이트를 코팅하는 데 사용됩니다.
   4. 0일차에는 2% 디메틸설폭사이드(DMSO)가 보충된 ES 세포 유지 배지(재료 표 참조)로 24시간 동안 세포를 처리합니다.
   5. 1-6일차에 상용 키트의 SMAD 억제제를 함유한 따뜻한(37°C) 신경 유도 배지로 전체 배지를 변경합니다(재료 표 참조). 세포가 분열하여 7일차 이전에 합류점에 도달하는 경우, 앞서 1.1.3단계에서 설명한 대로 0.5–1 x 10⁶의 파종 밀도로 세포를 계파합니다.
   6. 7일차에 세포 분리 용액(재료 표 참조)을 사용하여 24웰 플레이트의 1–2 x 10⁵ cells/well의 파종 밀도로 플레이트를 계대 NPC합니다.
   7. OCT4와 같은 다능성 마커의 부재 및 PAX6, Nestin 및 Sox1과 같은 NPC 마커의 존재에 대한 면역조직화학(IHC) 염색에 의한 분석 차별화 효율.
   8. 이 단계에서 분리된 NPC는 특수 상업용 NPC 냉동 매체(재료 표 참조)에서 동결하고 최대 3개월 동안 액체 질소에 보관할 수 있습니다. 한 번 동결 및 해동 된 후에도 NPC는 여전히 신뢰할 수있는 프로토콜을 가진 뉴런, 성상 세포 및 OPC를 생성 할 수있는 다능성을 유지합니다.
2. 희소돌기아교세포 전구세포(OPC) 생성(~7일). 흐름도는 그림 1A를 참조하십시오.
   1. 7일차에 세포 분리 용액(재료 표 참조)을 사용하여 NPC를 계파하고 따뜻한(37°C) 신경 유도 배지와 상용 키트의 SMAD 억제제에서 24웰 플레이트에 웰당 5개의 세포를 1–2 x 10⁵개의 파종 밀도로 플레이트화합니다(재료 표 참조).
   2. 8일차에 OPC 분화 배지에서 1% DMSO 용액을 준비하고 도금된 NPC를 24시간 동안 처리합니다. OPC 분화 배지는 기저(DMEM/F12) 배지, 1% N2 보충제, 1% B27 보충제, 20ng/mL의 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 1μM의 평활 작용제(SAG), 10ng/mL의 혈소판 유래 성장 인자(PDGF-AA)로 구성됩니다(재료 표 참조).
   3. 9일차에 배지를 DMSO가 없는 새로운 OPC 분화 배지로 교체합니다. 15일째까지 격일로 세포에 영양을 공급합니다. 세포가 Day 15 이전에 합류점에 도달하면 1.2.1 단계에서 설명한 대로 웰당 1–2 x 10⁵ 세포의 파종 밀도로 통과시킵니다.
   4. 14일차에 24웰 플레이트에서 1–2 x 10⁵ cells/well의 밀도로 OPC 분화 배지의 플레이트 OPC.
   5. 이 단계(15일차)에서 면역조직화학(IHC) 염색 또는 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)에 의한 OPC 특이적 마커의 존재 여부를 테스트하는 셀(예: O4, Olig1/2, CSPG4/Ng2, NKX2.2, PDGFRa; 그림 1B) NPC 마커가 없는 경우(Pax6 또는 Nestin; 그림 1D). 일반적으로 15일째에 세포의 95% 이상에서 O4 면역 반응을 검출합니다. 특히 알츠하이머병과 관련이 있는 것으로, OPC에서는 APP(아밀로이드 전구체 단백질), BACE1(처리 프로테아제 β-세크레타제 1) 및 펩타이드 아밀로이드-β(Aβ)의 발현이 풍부합니다(그림 1F).
3. 희소돌기아교세포(OL) 성숙(~7–20일)
   1. 15일차에 배지를 OL 성숙 배지로 교체합니다: Neurobasal-A 배지, 2% B27 보충제, 1μM 고리형 아데노신 일인산염(cAMP), 200ng/mL T3 트리요오드티로닌 및 1μM의 클레마스틴(재료표 참조). 격일로 또는 필요한 경우 매일 매체를 변경합니다.
   2. 세포가 90% 합류점에 도달하면 최대 2회 계대까지 또는 세포 분열이 상당히 느려질 때까지 1:3 비율로 분열합니다. OPC가 너무 빨리 분열하여 3일 이내에 포화에 도달하는 경우 1-3일 동안 2-5μM의 농도로 Ara-C(재료 표 참조)를 추가합니다. 활성 증식은 성숙 효율이 낮아졌음을 나타냅니다.
   3. OL 마커(예: CLDN11, PLP1, qPCR에 의한 MBP, IHC 염색 또는 면역블로팅)의 발현을 평가하여 희소돌기아교 성숙의 효율성을 조사합니다. 매우 복잡한 구조의 특징적인 형태(그림 1C)와 OL 마커의 발현(그림 1E)은 28일째까지 쉽게 검출되어야 합니다.

결과

그림 1: iOPC(유도 희소돌기아교세포 전구세포) 생성 및 iOL(유도 희소돌기아교세포) 성숙. (A) iOPC 및 iOL 생성의 흐름도. (B) 15일차 iOPC의 대표적인 명시야 및 면역형광 이미지. Olig2(범-올리고아덴드로글리아 마커)는 녹색, O4(OPC 마커)는 빨간색, DAPI는 파란색으로 표시됩니다. 이미징 결과 iOPC의 >95%가 O4에 양성이고 25%가 Olig2에 양성인 것으로 나타났습니다. (C) 28일차 iOL의 대표적인 명시야 및 면역형광 이미지. MBP는 녹색, O1은 빨간색, DAPI는 파란색으로 표시됩니다. (D) NPC 마커 PAX6의 발현은 14일째에 iO...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아카쿠타아제	스템셀 테크놀로지스	7920
B27 보충제	써모피셔	17504044
bFGF	써모피셔	PHG 0266 (영문
캠프	밀리포어시그마	A9501
클레마스틴	밀리포어시그마	SML0445
DMEM/F12 매체	스템셀 테크놀로지스	36254
디엠소	써모피셔	D12345
소 태아 세럼	사이엔셀	10
H1 인간 ES 세포	위셀	와01
마트리겔	코 닝	354234
mTeSR 플러스	스템셀 테크놀로지스	5825
N2 보충제	써모피셔	17502001
Neurobasal A 배지	써모피셔	제10888-022
비 필수 아미노산	써모피셔	제11140-050
PDGF-AA〈블랙	R&D 시스템	221-AA-010
pMDLg/pRRE	애드진	12251
폴리브레네	밀리포어시그마	TR-1003-G
pRSV-레브	애드진	12253
ROCK 억제제 Y-27632	스템셀 테크놀로지스	72302
처짐	토크리스	4366
STEMdiff 신경 전구 냉동 매체	스템셀 테크놀로지스	5838
STEMdiff SMADi 신경 유도 키트	스템셀 테크놀로지스	8581
T3 트리요오드티로닌	밀리포어시그마	T6397
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