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1. 인간 만능 줄기 세포에서 인간 뉴런 유도
- 렌티바이러스 준비(~5일)
- 각 T75 플라스크에 ~100만 개의 인간 배아 신장 293T(HEK293T) 세포를 플레이트화하여 transfection을 수행할 때 ~40%가 융합되도록 합니다. 테트라사이클린 유도성 뉴로제닌 2(Ngn2) 및 퓨로마이신 내성 유전자(PuroR, 동일한 Tet operator(TetO) 프로모터 제어 하에), 역테트라사이클린 트랜스액tivator(rtTA) 및 3가지 도우미 플라스미드 pRSV-REV, pMDLg/pRRE 및 VSV-G(렌티바이러스 벡터 DNA 12μg 및 보조 플라스미드 DNA 각 6μg)를 발현하는 플라스미드로 transfection합니다. 렌티바이러스 제제당 최소 3개의 플라스크를 준비합니다. 제조업체의 지침에 따라 transfection을 위해 polyethylenimine (PEI)을 사용하십시오. 16시간 후에 미디어를 교체하고 폐기하십시오.
- Harvest는 매일 배양 배지를 수집하여 바이러스 입자를 방출하고 3일 동안 새로운 배지로 교체했습니다. 정제를 위해 바이러스 입자가 포함된 수집된 배지를 풀링합니다. 0.22μm 필터를 통해 바이러스를 여과하고 49,000 x g에서 90분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 적절한 양의 인산염 완충 식염수(PBS)-포도당(~150μL)에 재현탁합니다.
- 뉴런 유도 (~5일)
메모: 이 유도 프로토콜(그림 1A, 흐름도)은 검증된 다능성의 유도 만능 줄기(iPS) 및 배아 줄기(ES) 세포 모두에 매우 효과적입니다(이는 잘 특성화된 다능성 마커의 면역조직화학 염색으로 분석할 수 있음). 그림 1B).
- 52의 통로에서 시판되는 H1 인간 ES 세포를 사용합니다(재료 표 참조). ES 세포 유지 배지(재료 표 참조)를 사용하여 코팅된 6-well plate(6-well plate당 ~0.5 mg의 matrix solution, Table of Materials)에서 세포를 배양하고 37°C에서 5% CO2로 플레이트를 배양합니다.
- -2일차에, 세포 분리 용액 1mL(재료 표 참조)로 ES 세포(80% 융합)를 분리하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 세포를 튜브로 옮기십시오. 2mL의 배지로 웰을 세척하고 동일한 튜브에 결합하십시오. 300 x g에서 5분 동안 원심분리기를 가열하고, 펠릿을 배지에 재현탁시키고, 세포를 웰당 1 x 105 cells의 파스딩 밀도로 매트릭스로 코팅된 6-well plate에 plateing합니다.
- Day -1에 폴리브레네(8 μg/ml)와 함께 Ngn2와 PuroR 및 rtTA를 발현하는 렌티바이러스를 새로운 ES 세포 유지 배지의 ES 세포에 추가합니다(재료 표 참조). 바이러스의 정확한 수는 실제 역가 또는 적정에 의해 결정되어야 합니다. 일반적으로 6-well 플레이트에 웰당 각 5μL를 추가합니다.
- 0일차에 모르포겐이 없는 N2 보충제와 함께 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지/영양 혼합물 F-12(DMEM-F12) 배지에 Doxycycline(2μg/mL, Ngn2 발현 활성화)을 추가합니다.
- 1일차에 DMEM-F12와 N2 및 독시사이클린의 새로운 배지에 퓨로마이신을 첨가하여 최종 농도인 1μg/mL 배지에 추가합니다. 최소 24시간 동안 Puromycin에서 형질도입된 세포를 선택합니다. 바이러스 역가가 낮은 경우 형질도입된 세포를 적절하게 제거하기 위해 더 높은 Puromycin 농도(최대 5μg/mL)와 더 긴 선택 기간(최대 48시간)이 필요할 수 있습니다.
- 2일차에 세포 분리 용액(Table of Materials)으로 분화 뉴런을 분리하고, 매트릭스 용액(Table of Materials)으로 코팅된 24-well plate(80,000–200,000 cells/well)에 다시 플레이트를 삽입하고, doxycycline이 없는 neurobasal-A(NBA)/B27 medium으로 유지합니다. 파종 밀도는 매우 중요합니다.
- 이 단계에서 분리된 뉴런은 특수 상업용 냉동 매체(재료 표 참조)에서 동결하고 최대 3개월 동안 액체 질소에 보관할 수 있습니다. 순수 뉴런은 해동 후 전형적인 ~15%-20%의 세포 사멸을 설명하며, 단독으로 배양하거나 다른 뇌 세포 유형과 공동 배양할 수 있습니다(OPC와의 공동 배양은 3.2.3단계 참조).
- 제조업체의 지시에 따라 세포외 기질 기반 용액으로 코팅된 플레이트에서 순수 iN을 배양합니다(재료 표 참조). 특징적인 피라미드 형태는 4일차(및 6일차; 그림 1C). 시냅스 형성은 빠르면 14일에서 16일째에 감지할 수 있으며 표준 시냅스 전후 마커를 사용한 면역조직화학적 염색에 의해 24일째에 두드러집니다. (그림 1D; 시냅스 전 마커 Synapsin 1 및 수지상 마커 Map2로 표시됨).
2. 만능 줄기 세포와 희소돌기아교구 성숙에서 인간 희소돌기아교세포 전구세포(OPC) 유도
- NPC(Neural Progenitor Cell) 생성: 단층 프로토콜(~7일). 흐름도는 그림 2A를 참조하십시오.
- 앞서 설명한 대로 H1 인간 ES 세포를 배양하고(1.2.1단계 참조) 다중 신호 경로를 위한 저분자 억제제를 사용하여 이중 SMADi라는 확립된 접근 방식을 통해 신경 전구 세포(NPC)로 트랜스 분화합니다. 여기에서는 널리 사용되는 상용 키트를 사용하고 제조업체에서 제공하는 단층 프로토콜을 따릅니다(재료 표 참조).
- -1일차에 성장 인자 감소 매트릭스 용액(재료 표 참조; 6웰 플레이트당 ~0.5mg의 매트릭스 용액)으로 코팅된 6웰 플레이트의 웰당0.5–1 x 10 6개 세포 플레이트를 ES 세포 유지 배지(재료 표 참조)로 코팅합니다. 이 성장 인자 감소 매트릭스 용액은 다음 단계에서 사용될 모든 플레이트를 코팅하는 데 사용됩니다.
- 0일차에는 2% DMSO가 보충된 ES 세포 유지 배지(재료 표 참조)로 24시간 동안 세포를 처리합니다.
- 1-6일차에 상용 키트의 SMAD 억제제를 포함하는 따뜻한(37°C) 신경 유도 배지로 전체 배지를 변경합니다(재료 표 참조). 세포가 분열하여 7일차 이전에 합류점에 도달하는 경우, 앞서 2.1.2단계에서 설명한 대로 0.5–1 x 106의 파종 밀도로 세포를 통과시킵니다.
- 7일차에 세포 분리 용액(재료 표 참조)을 사용하여 24웰 플레이트의 1–2 x 105 cells/well의 파종 밀도로 플레이트를 계대 NPC합니다.
- 다능성 마커, 예를 들어 Octamer 결합 전사 인자 4(OCT4)의 부재 및 쌍 상자 6(PAX6), 네스틴 및 성 결정 영역 Y-box 전사 인자 1(Sox1)과 같은 NPC 마커의 존재에 대한 면역조직화학(IHC) 염색에 의한 차별화 효율을 분석합니다.
- 이 단계에서 분리된 NPC는 특수 상업용 NPC 냉동 매체(재료 표 참조)에서 동결하고 최대 3개월 동안 액체 질소에 보관할 수 있습니다. 한 번 동결 및 해동 된 후에도 NPC는 여전히 신뢰할 수있는 프로토콜을 가진 뉴런, 성상 세포 및 OPC를 생성 할 수있는 다능성을 유지합니다.
- 희소돌기아교세포 전구세포(OPC) 생성(~7일). 흐름도는 그림 2A를 참조하십시오.
- 7일차에 세포 분리 용액(재료 표 참조)을 사용하여 NPC를 계파하고 따뜻한(37°C) 신경 유도 배지와 상용 키트의 SMAD 억제제에서 24웰 플레이트에 웰당 5개의 세포를 1–2 x 105개의 파종 밀도로 플레이트화합니다(재료 표 참조).
- 8일차에 OPC 분화 배지에 1% 디메틸설폭사이드(DMSO) 용액을 준비하고 도금된 NPC를 24시간 동안 처리합니다. OPC 분화 배지는 DMEM/F12 배지, 1% N2 보충제, 1% B27 보충제, 20ng/mL의 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 1μM의 평활 작용제(SAG), 10ng/mL의 혈소판 유래 성장 인자-AA(PDGF-AA)로 구성됩니다(재료 표 참조).
- 9일차에 배지를 DMSO가 없는 새로운 OPC 분화 배지로 교체합니다. 15일째까지 격일로 세포에 영양을 공급합니다. 세포가 Day 15 이전에 합류점에 도달하면 2.2.1 단계에서 설명한 대로 웰당 1–2 x 105 세포의 시딩 밀도로 계대시킵니다.
- 14일차에 24웰 플레이트에서 1–2 x 105 cells/well의 밀도로 OPC 분화 배지의 플레이트 OPC.
- 이 단계(15일차)에서 IHC 염색 또는 qPCR에 의한 OPC 특이적 마커의 존재 여부를 테스트하는 세포(예: O4, 희소돌기아교세포 계통 전사 인자[Olig]-1/2, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4/뉴런-아교세포 항원 2[CSPG4/Ng2[, NK2 Homeobox 2[NKX2.2], 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파[PDGFRa]; 그림 2B) NPC 마커가 없는 경우(Pax6 또는 Nestin; 그림 2D). 일반적으로 15일째에 세포의 95% 이상에서 O4 면역 반응을 검출합니다. 특히 알츠하이머병과 관련이 있는 OPC에서는 APP(아밀로이드 전구체 단백질), BACE1(가공 프로테아제 β-secreatase 1) 및 펩타이드 아밀로이드-β(Aβ)의 발현이 풍부합니다(그림 2F).
3. 인간 유도 뉴런(iN)과 희소돌기아교세포 전구세포(iOPC)의 공동 배양
- iOPC 도금 (~3일)
- OPC 분화 배지(단계 2.2.2에서 설명)에서 24-웰 플레이트(단계 2.2.4에서 상기 설명 참조)의 웰당1 x 10 5개 세포의 밀도로 14일째에 플레이트 iOPC.
- iN-iOPC 공동배양 구축
- 15일째에, 세포 분리 용액(Table of Materials)으로 Puromycin 선택(1.2.6단계에서 설명)을 수행한 후 2일차 단계에서 유도된 인간 뉴런을 분리한다.
- 배양된 OPC에 뉴런을 추가하고, 성장하는 OPC와 함께 24웰 플레이트에서 웰당 2 x 105 세포의 파종 밀도로 도금합니다(단계 3.1.1에서). Neurobasal-A 배지, 2% B27 보충제 및 100ng/mL T3 트리요오드티로닌을 포함하는 공동 배양 배지를 사용합니다. 다음 날에 매체를 변경하고 그 이후에는 격일로 매체를 변경합니다. OPC가 너무 빨리 증식하여 3일 이내에 포화도에 도달하는 경우 2–5μM 농도의 시토신 아라비노사이드(Ara-C)를 첨가합니다. 7일 뉴런 후 공동 배양에서 성장한 iNs 및 iOPC의 대표적인 이미지가 그림 3A에 나와 있습니다.
- OPC와의 공동 배양을 위해 1.2.7단계에서 위에서 설명한 대로 준비된 동결 뉴런을 사용합니다. 플레이트는 웰당 3 x 105개의 세포의 더 높은 밀도로 뉴런을 동결 및 해동합니다.
- 공동 배양에서 14-16일째 이후, iNs의 시냅스 형성은 시냅스 전후 마커의 IHC 염색을 통해 관찰할 수 있으며, 21일째까지 시냅스 반점이 풍부해야 하고(그림 3C) 신경 활동을 안정적으로 기록할 수 있습니다.
- 21일차부터 세포에서 OL 특이적 마커(예: 미엘린 염기성 단백질[MBP] 및 단백질지질 단백질 1[PLP1])를 테스트합니다. 28일째까지, 우리는 일반적으로 특정 마커에 대한 IHC 염색으로 표지된 iOL 프로세스에 의한 iN 축삭돌기의 외피 현상을 관찰합니다(그림 3B, iN 축삭돌기의 경우 뉴로필라멘트[NF], iOPC 돌기의 경우 MBP).
