두개골 방사선 치료에 의한인지 기능 장애의 회복을위한 세포 이식 전략을 줄기

우리 실험 계획은 간략하게 구조 그림 1에 diagrammed입니다.

1. 이식에 대한 인간의 신경 줄기 세포 (NSCs)의 성장과 준비

1. EnStem - 세포주 (EMD Millipore)는 본 연구에서 사용되었다. NSCs은 정기적으로 높은 multipotent 마커 nestin과 Sox2의 표현 수준 및 다중의 연결 phenotypes으로 차별하고 이후에 정상적인 핵형을 유지하는 능력과 함께 pluripotent 마커 월 4, 낮은 수준의 표현을위한 제조 업체에서 확인 아르 여러 구절. 우리의 성장 조건이 NSCs는 Sox2와 nestin의 풍부한 표현을 표시하고 이전 ¹ 설명한 바와 같이, 차별화하는 능력을 유지. NSCs는 폴리 - L - ornithine (20 μg / ML) 및 laminin (5 μg / ML) 코팅 조직 문화 처리 flasks을에서 성장했다. 전지는 L - 글루타민 (2 ㎜)과 보충 신경 확장 매체 (Millipore) 및 기본 fibroblast에서 재배되었다성장 인자 (bFGF, 20 NG / ML). NSCs의 자기편 monolayers는 분리 에이전트 ^1로 accutase와 함께 매일 (1시 2분) passaged되었습니다. 이식 연구에 대한, NSCs 10 다음 구절에 사용되었습니다.
2. NSCs 전에 이식 사흘 4 μm의 BrdU와 성장 미디어를 보완하여 5 브로모 - 2' - deoxyuridine (BrdU)으로 표시했다. BrdU 라벨 인덱스 (BrdU 양성 세포 즉 비율)를 확인하려면 전지는 실내 슬라이드에 도금 및 표준 immunocytochemical 접근법을 사용하여 BrdU 감지 처리되었습니다. 이식에 대한 이용 세포는 정기적으로 90% ² 초과 인덱스를 레이블링 나타냅니다. 또한, 이식된 인간의 줄기 세포는 인간의 구체적인 핵 항원 마커 (HuNu) ^2를 사용하여 감지되었습니다.
3. 이식의 날, accutase 및 신경 확장 미디어는 37 ° C의 물을 욕조에 미리 기까지했다. 전지는 (배양 매질에 배치되었습니다 10 μm의를 포함하는 신경 확장 미디어Y - 27632 중) 1 시간. Y는 - 27632 (바위 억제제 EMD - Calbiochem)이 NSCs 후 이식의 생존을 향상시키기 위해 사용되었습니다.
4. 오분 한 시간 후에, 부화 미디어는 제거하고 세포 accutase로 치료했다. 이 간단한 치료 후 accutase을 중화하고 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포를 변형하기 위해 신경 확장 미디어의 동일한 볼륨을 추가합니다.
5. 혈구계로 세포를 카운트하고 사출 매체 microliter 당 1.0 × 10 ⁵ 라이브 NSCs을 (신경 확장 미디어 Y - 27632, 40 NG / ML bFGF, 20 NG / ML BDNF의 10 μm의를 포함하는) 준비합니다.
6. 세포는 신경 확장 미디어에 저장합니다 (1.5에서 설명)과 이식의 시간까지 얼음에 보관하고, 차가운 스토리지 연장하여 세포 사망을 최소화하기 위해 6h 이내에 사용해야했다.

2. 방사선 치료 - 치료 계획 및 조사

1. 진정 athymic 누드 쥐 (들)은 경향이 positio에 실험실 MRI 스캐너에 배치되었다 N 뛰어난 끝에 두개골과 (헤드 퍼스트). 이 3 테슬라의 스캐너는 작은 동물 스캔을 위해 설계되었습니다. 그것은 높은 공간 해상도 교차 단면 (축) 이미지로 훌륭한 부드러운 조직 대조를 제공할 수 있습니다. 0.8 mm 이미지 두께 두개골 지역 22 T2 가중 E60 이미지의 집합에 초점을 맞춘 검사가 생성되었습니다. 이러한 이미지는 쥐의 두뇌 속에 왼쪽과 오른쪽 hippocampi를 식별하는 데 필요한 정보를 제공합니다.
2. MRI 스캔 (24), 동물 마취 되었어요 [마취 칵테일 (케타민을, 30 MG / kg, xylazine, 2.5 MG / kg과 acepromazine 1 MG / kg)] 다음 다른 교차 단면 방사선 종양학 중부 표준시 스캐너에 배치 (축) 이미지 볼륨이 생성되었습니다. 쥐가에 배치되었다 동일 또는 MRI 검사에 사용되며 중부 표준시 단위 두개골 영역을 검사하도록 설정되었습니다과 같은 위치로 닫습니다. 0.8 mm 이미지 두께 중부 표준시 01시 06분 이미지의 연구는 중부 표준시 처리 계획 데이터 된 어떤 생성되었습니다.
3. 치료 계획헥타르 ">
4. MRI 및 중부 표준시 이미지 데이터는 DICOM (의학 디지털 이미징 및 통신)를 통해 이클립스 (Varian 의료 시스템, 팔로 알토, CA) 치료 계획 소프트웨어로 전송되었습니다. 이클립스는 환자에 가장 적합한 방사선 치료 계획을 모델과 설계 방사선 종양학에 사용되는 정교한 상용 소프트웨어입니다. 그것은 중부 표준시 이미지 데이터에서 추출되어 신체 내에서 방사선 선량 분포를 계산하는 데 사용되는 장기 밀도 정보를 포함합니다.
5. 노출은 머리 작은 수술 드레이프를 사용하여 동물을 커버. 외이도 (外耳道)에 귀 막대를 삽입하여 단단히 stereotaxic 프레임 (벤치 마크 디지털, Leica - myNeurolab) 내에 동물 머리를 놓습니다. 귀 운하에 귀 표시줄의 팁을 슬라이딩 때 극도의 몸조심. 쥐의 상단 incisors를 연결해야하고 표준 참조 지점에 막대 높이를 조정하여 앞니 막대를 삽입 후, 코를 클램프를 조인다.
6. 센터 위치stereotaxic 제로를 달성하기위한 최소한의 측면 운동 (± 4 ㎜)과 귀 막대 사이의 머리.
7. 그 과정에서 다음 단계는 사용할 방사선 기술을 결정하는 것입니다. RapidArc의 형태로 강도 - 변조 방사선 치료 (IMRT)와 volumetrically - 변조된 아크 치료 (VMAT)은 방사선 선량 ^3-6 전달하기 위해 6 MV 광자 빔을 사용이 고정밀 방사선 기술입니다. 이러한 기술의 차이는 IMRT가 여러 정적 궤도에 다른 방향으로 각 해당를 사용하지만, 매우 작은 대상 볼륨에 대한 더 적합한 대상 볼륨에 수렴 복용을 제공한다는 것입니다. RapidArc는 반면에, 대상 지역 (그림 4)에 초점을 맞춘 하나 이상의 자르크를 통해 동적으로 복용을 제공합니다.
8. 에 관계없이 전달 기술, 대상 복용에 대한 정보, 대상 적합성과 중요 장기 선량 제약은 이클립스에서 선량 최적화 윈도우에 입력해야합니다. 티장기 볼륨과 함께 자신의 정보를 지속적으로 조사 중에 빔 감쇠 변화에 의해 이루어집니다 맞게 복용 배포하는 데 사용됩니다.
9. 일단 계획이 생성되었습니다, 이클립스는 축, 코로나와 화살 이미지 (그림 5)뿐만 아니라 복용 - 볼륨 히스토그램 (DVH) 형식 (그림 6)로 겹쳐 계산 복용량을 제공합니다. 그것은 그것이 전달 또는 개선되어야 적합 경우 계획이 결정하기 위해 평가해야 할 때이 시점에 있습니다.

3. 인간 줄기 세포의 내부 hippocampal 이식을위한 수술 Stereotaxic

1. nimals 축산 및 수술 준비
   1. 이 연구에 대해서는 국립 암 연구소 (NIH - rnu 변형 0N01 CR)로부터 얻은 이개월 된 ATN의 쥐를 고용. 동물들은 무균 케이지에 보관하고 온도와 12-h/12-h 라이트 / 어둠주기 빛을 제어 배리어 환경에서 유지되었다. 쥐이 autoclaved 음식과 물을 광고 libitum을 제공되었으며주의 Vetropolycin 아이 연고 (서양 의학 공급, 아카디아, CA)와 매주 눈을 세척하여 안구 감염을 방지하기 위해 이동했다.
   2. stereotaxic 수술, 쥐가 마취 칵테일의 IP 주사 (케타민을, 30 MG / kg, xylazine, 2.5 MG / kg과 acepromazine 1 MG / kg)와 anesthetized되었습니다. 10-15분 및 진정 작용이 만져서 알 수있는 반사 (발가락 핀치)를 사용하여 모니터링할 완료 후 마취가 유도되었다. 수술하는 동안 필요한 경우, 원래 복용량의 15~20%는 충분한 마취를 유지하기 위해 주어진 수 있습니다.
   3. 전기 면도기를 사용하여 머리에서 모피를​​ 제거합니다. 대략수술 영역 200 %의 머리카락에 의해 감염을 막기 위해 면도한다. providone / 절개하기 전에 70 % 알코올 (3 회) 다음 요오드 (3 번)을 사용하여 깨끗한 면도하는 부분입니다.
2. Stereotaxic 수술
   1. Stereotaxic 인 스트 루먼트 (디지털 모니터와 프레임), micromotor 훈련, 건조 침대 살균기와 컨트롤러는 ATN의 쥐의 수술 절차 중에 가능한 감염을 방지하기 위해 층류 후드에 보관한다. 임베디드 가열 패드와 stereotaxic 단계는 수술하는 동안 동물이 따뜻하게 유지하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 수술 thoughout '킴벌리 - 클락 Safeskin 자주색의 Nitrile 무균 시험 장갑'을 사용합니다. 이 장갑은 개별적으로 (Cat. 번호. 55093) 멸균 봉투에 포장됩니다. 또한, 외과의는 수술시 비누로 손을 소독 70 % 알코올 스프레이를 사용합니다.
   2. 노출은 머리 작은 수술 드레이프를 사용하여 동물을 커버. 귀를 학사 학위를 삽입하여 단단히 stereotaxic 프레임 (벤치 마크 디지털, Leica - myNeurolab) 내에 동물 머리를 위치외이도 (外耳道)로 RS. 귀 운하에 귀 표시줄의 팁을 슬라이딩 때 극도의 몸조심. 쥐의 상단 incisors를 연결해야하고 표준 참조 지점에 막대 높이를 조정하여 앞니 막대를 삽입 후, 코를 클램프를 조인다.
   3. 센터 stereotaxic 제로를 달성하기위한 최소한의 측면 운동 (± 4 ㎜)과 귀 막대 사이에 머리의 위치.
   4. 다음 위치 단계에 따라, 건조를 방지하고 가능한 요오드 또는 알코올 유출에서 그들을 보호하기 위해 눈의 윤활 연고를 적용할 수 있습니다. 수술하는 동안이 연고 적어도 2 번 사용합니다.
   5. 멸균 메스를 사용하여 두피 따라 중간선에 피부 절개 (2cm)을 만들고, 멸균 면봉을 사용하여 청소가 작은 주걱을 밀고. 꼬리와 목 근육의 영역에 손상을 피하십시오.
   6. 해부 견인기를 사용하여, 면화 밀고 작은 주걱을 사용하여 골막을 열어 맑은 부드러운 조직을 개최 1 % 과산화수소 (PBS에서 만든)에 담근. 출혈을 멈추게하려면 최소한 1 MI에 대한 확고한 압력을 유지N 면화를 사용하면 작은 주걱이나 거즈를 밀고. 두개골 봉합은 bregma 및 람다 볼 때까지 머리와 피부를위한 dabbing 운동을 청소 회사 사장을 때릴 때의 모션을 적용합니다.
   7. bregma에 참조된 정확한 stereotaxic 좌표는, 쥐의 뇌 아틀라스 ^7을 사용 결정됩니다. 줄기 세포 이식은 다음 stereotaxic 좌표를 사용하여 각 반구에 대한 뚜렷한 사이트에서 수행되었습니다
      1. 두뇌의 표면에서 bregma에서 Anterio - 후부 (AP) 3.0 mm, 중간선에서 아주 작은 - 측면 (ML) 1.8mm, 그리고 dorso - 복부 (DV) 3.2mm.
      2. AP, 3.6 mm, ML, 2.5 mm, DV, 3.2 mm
      3. AP, 4.2 mm, ML, 3.2 mm, DV, 3.2mm
      4. AP, 4.2 mm, ML, 3.2 mm, DV, 3.2mm
   8. bregma가 확인되면, 세 좌표는 (AP, ML 및 DV) 디지털 디스플레이 / 컨트롤러 (디지털 stereotaxic 프레임)에 제로해야합니다. 그렇다면 앞서 말한 좌표를 사용하여 정확한 이식 사이트를 (마르크로 이동) 프레임에있는 작은 프로브 홀더에 부착된 훌륭한 포인트 마커 펜과 함께.
   9. 발 페달 제어 micromotor 훈련 (Leica - myNeurolab)를 사용하여 두개골을 통해 0.35mm 구멍 (제 4분의 1 치과 버, 초경 바나듐 드릴 비트)를 드릴. 경질 막의 손상을 방지하는데주의를 기울여야. 출혈이 시추하는 동안 발생하는 경우, 면화 밀고 작은 주걱을 사용하여 회사에 압력을 적용합니다. 이것이 동물에게 자극의 원인이되므로, 드릴 사이트에서 알코올이나 요오드을 적용하지 마십시오.
   10. 쥐 5 μL 해밀턴 microsyringe을 (30 게이지)를 사용하여 1 μL의 최대 볼륨에 주입 NSCs의 정지 양자 내부 hippocampal 주사를 받았다. 이 볼륨 내에서 세포의 정확한 숫자는 실험적인 세부 사항에 따라 달라집니다. 이것을 달성하기 위해, microsyringe가 stereotaxic 프레임에서 작은 프로브 홀더에 붙어 있 었지. 두뇌의 표면 (즉 meninges)를 도달하기 전까지 두개골에있는 바늘의 팁을 조심스럽게를 삽입합니다. 이 시점에서, DV coordina테는 디지털 디스플레이 / 컨트롤러에 제로해야 다음, 부드럽게 원하는 깊이 (DV, 3.2 mm)에 바늘을 삽입합니다. 세포의 주입을 시작하기 전에 1 분 정도 기다립니다.
   11. 0.25 μL 볼륨 / 타이머를 사용하는 분 (느린 릴리즈) 주사. 1 μL의 총이 주입되면 이식 사이트에서 retracting 바늘 전에 8 분을 기다립니다. 이 시간 이후, 서서히 바늘 트랙을 통해 다시 사출 내용 모세 역류를 방지하기 위해 이식 사이트 (0.5 mm / 분)에서 바늘을 철회.
   12. 나머지 이식 사이트 (반구 ​​당 4) 단계 3.2 (JK)를 수행합니다.
   13. 두개골에서 피부 견인기를 제거하고 부드럽게 다시 철회 피부를 당겨와 Autoclips 수술 봉합 applier (Leica - myNeurolab)를 사용하여 4-5 살균 스테인레스 클립을 적용하기 위해 무딘 핀셋을 사용합니다.
   14. 프레임에서 동물을 제거한 후 진통제와 주사 (Buprenorphin, 0.1 MG / kg, SC, 모든 12h) 및 (5 mL/250 g 성인 쥐, SC) 벨소리의 솔루션을 Lactated.
   15. 가열 패드에 보관해야합니다 그 케이지에있는 동물을 돌려 놓습니다. 그것은 지주 객실로 돌아오기 전에 의식이 될 때까지 동물을 모니터링합니다. 일부는 각 동물 케이지에서 별도의 배양 접시에있는 알약 (동물 차우)와 transgel를 moistened 놓습니다. 또는 DietGel 복구 (ClearH ₂ O, 포틀랜드, ME) 물, 영양소의 소스로 사용할 수 있습니다.
   16. 그들의 복구 시간 동안 동물을 모니터링과 고통, 고통, 붉어지는 것 또는 수술 사이트의 감염의 흔적을 확인 진통제 (buprenorphine 0.02 밀리그램 / kg (2 일간 모든 12h). 적용할 수 있습니다. (2까지 providone / 요오드 또는 neosporin 연고 하루에 한 번씩을 적용 감염, 통증이나 고통의 흔적은 수술 12 시간 이내 진통제 또는 항생제 치료를 계속하는 경우 다음과 같은 가능한 감염을 방지하기 위해 -3 일)., 추가 지원 수의사 또는 동물 관리 직원에게 문의하십시오.

4. 대표 결과 :

iles/ftp_upload/3107/3107fig1.jpg "/>
그림 1. 우리 실험 계획의 도식 표현.

그림 2. 중부 표준시 (뼈다귀 해부학)와 MRI (소프트 조직) 이클립스 소프트웨어 내에서 이미지의 융합. , 축 코로나, 그리고 화살 섹션 일치하는 것은 각각의 이미징 양상에서 파생된 쥐 두뇌의 중요한 해부 학적 기능의 공동 레지스트리에 대한 수 있습니다.

그림 3. 두뇌의 hippocampal 지역 Contoured. 이미지 융합 이후에, hippocampi 제외 hippocampi과 두뇌를 식별하고 axially 이들 기관에 대한 구체적인 체적 영역을 정의 contoured 있습니다. 이 지역은 원하는 대상 (들)에 선량 분포를 조정에 필요한 해부 및 볼륨 정보를 제공합니다.

ure 4 "SRC ="/ files/ftp_upload/3107/3107fig4.jpg "/>
그림 4. RapidArc의 형태로 강도 - 변조 방사선 치료 (IMRT) 또는 volumetrically - 변조된 아크 치료 (VMAT)를 사용하여 고정밀 방사선 옵션을 제공합니다. 이러한 기법은 6 MV 광자는 아주 작은 대상 볼륨을 추적 할 수 여러 정적 궤도로 두 빔 제공 (IMRT), 또는 동적으로 대상 지역 (RapidArc)에 초점을 맞춘 하나 이상의 자르크로.

그림 5. 축방향 이미지에 겹쳐 이클립스 계산 복용. 표시된 복용량은 싱글 또는 듀얼 hippocampi의 방사선 치료 계획을위한 것입니다.

그림 6. 일식은 투여량 - 볼륨 히스토그램을 계산. 데이터의 단일 hippoc에서 비 조사 hippocampal 볼륨 대 조사의 비율을 대조ampus 처리 계획은 그림에 표시됩니다. 5.

그림 7. 방사선 치료에 대한 이미지 유도 쥐 위치. 이클립스의 중부 표준시 처리 계획 데이터에서 생성 직교 디지털 복원 방사선 (DRR) 이미지는 삼부작의 온보드 영상 (오비) 시스템과 함께 찍은 치료 테이블에 쥐 직교 X - 선 이미지를 융합하고 있습니다. DRRs는 두개골과 오비 이미​​지와 함께 공동 등록을 촉진 다른 뼈다귀 랜드마크를 강조 뼈 밀도에 가중치입니다. 이러한 집합과 일치하는 것은 중부 표준시와 X - 선 이미지의 공동 등록을 달성하기 위해 만들해야 치료 테이블 위치 교대를 제공합니다.

그림 8. stereotaxic 수술 다음 이식 NSCs의 위치. 사후 이식 1 개월에서 동물 perfused 있었다 뇌는 구역되었습니다D 및 BrdU (이식 NSCs을 감지) 및 hematoxylin과 카운터 스테인드 묻다. 바늘 트랙 (NT, 레드 라인)은 그냥 코퍼스의 callosum (CC) 아래와 CA1 위, 장기 이식 릴리스 사이트 (TR)에서 NSCs을 입금 사출 궤도를 나타냅니다. 이식 NSCs는 호스트 해마 (; 이가있는 hilus, DH, CA1과 CA3 subfields, 배율 X4 이가있는 이랑, DG)을 통해 TR의 광범위한 마이 그 레이션을 보여주었다. 스케일 바, 200 μm의.

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.