유도 만능 줄기 세포에서 소뇌 세포의 2D 단층을 생성하는 기술

초록

출처: Madencioglu, D. A., et al. 2D 구조에서 체외 인간 소뇌 발달 모델링.J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 인간 유도 만능 줄기 세포를 소뇌 전구 세포로 분화시키는 프로토콜을 보여줍니다. 여기에는 줄기세포 군체를 초저 부착 플레이트로 옮겨 배아체를 형성하고, 성장 인자로 분화를 촉진한 다음, 배아체를 접착을 위해 매트릭스 코팅된 플레이트로 옮기는 작업이 포함됩니다. 후속 단계에는 세포 이동을 유도하고 성숙 배지를 추가하여 글루타메이터 및 GABAergic 소뇌 신경 세포 전구체와 Purkinje 세포 전구체의 발달을 안내하는 것이 포함됩니다.

프로토콜

1. 실험적 준비

1. 기저막 매트릭스(BMM) 코팅 플레이트를 준비합니다.
   메모: BMM은 따뜻한 온도에서 더 빨리 응고됩니다. 플레이트는 신속하게 준비하고 즉시 4°C에 보관해야 합니다.
   1. BMM(재료 표 참조)을 얼음 위에서 4°C에서 최소 2시간 동안 또는 밤새 해동합니다.
   2. Dulbecco의 Modified Eagle Medium(DMEM)/F12 및 BMM을 최종 농도 80μg/mL로 혼합합니다. 조직 배양 접시(35mm 접시의 경우 1mL, 60mm 접시의 경우 2mL)에 BMM 용액을 분배하고 세포를 도금하기 전에 37°C에서 최소 1시간 동안 또는 밤새 배양합니다.
      알림: 사용하지 않은 접시는 4 °C에서 2 주 동안 보관할 수 있습니다.
2. 폴리-L-오르니틴/라미닌(PLO/라미닌) 코팅 플레이트를 준비합니다.
   1. 멸균 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS+/+)에 20μg/mL PLO(재료 표 참조)를 준비하고 6웰 플레이트의 각 웰에 1mL를 추가합니다. 인큐베이터에서 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
   2. 다음 날, 진공 흡입기로 PLO를 흡입하고 DPBS+/+로 두 번 세척합니다. 후드에서 자연 건조합니다 .
      알림: 공기 건조된 플레이트는 나중에 사용할 수 있도록 알루미늄 호일로 싸서 최대 2주 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
   3. DPBS+/+로 10μg/mL 라미닌(재료 표 참조)을 준비하고 6웰 플레이트의 각 웰에 1mL를 추가합니다. 인큐베이터에서 최소 3시간 동안 또는 37°C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
   4. 진공 흡입기로 라미닌을 흡입하고 1mL의 배지 또는 멸균 DPBS+/+.
      를 추가합니다. 알림: 라미닌 코팅이 마르지 않아야 합니다. 이를 방지하기 위해 PBS 또는 적절한 배양 배지를 즉시 추가해야 합니다. 코팅된 플레이트는 4°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다.
3. PSC passaging 용액을 준비합니다.
   1. 11.49g의 염화칼륨(KCl)과 0.147g의 구연산나트륨 이수화물(HOC(COONa)(CH₂COONa)₂*2H₂O)을 400mL의 멸균 세포 배양 등급 물에 용해합니다(재료 표 참조).
   2. 용액의 부피를 측정하고 이를 초기 부피(Vi)로 기록합니다.
   3. 삼투압을 측정하고 공식 Vi × Oi = Vf × 570 mOsm을 사용하여 멸균 세포 배양 등급의 물을 추가하여 570 mOsm으로 조정합니다.
   4. 0.20μm 필터로 용액을 필터 멸균하고 10mL 부분 표본을 만듭니다. 부분 표본은 실온(RT)에서 최대 6개월 동안 보관합니다.
4. 만능 줄기 세포(PSC) 배지를 준비합니다.
   참고: iPSC는 열 안정성 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2)를 함유한 배지에서 유지되며(재료 표 참조) 주말에 먹이를 주지 않습니다. 다른 상업적으로 이용 가능한 PSC 미디어는 이 프로토콜에 대해 시도되지 않았습니다.
   1. PSC 배지 보충제를 4°C에서 밤새 해동합니다.
   2. PSC 배지 보충제 10mL를 기초 PSC 배지 500mL에 추가합니다. 25mL 부분 표본을 만들고 -20°C에서 보관합니다.
      참고: 냉동 부분 표본은 -20°C에서 6개월 동안 보관할 수 있습니다. 해동된 부분 표본은 4°C에서 보관해야 하며 2주 이내에 사용해야 합니다. 세포는 10%(v/v) 디메틸설폭사이드(DMSO)가 포함된 PSC 배지에 장기간 보관하기 위해 동결할 수 있습니다.
5. PSC 해동 매체를 준비합니다.
   1. PSC 배지에 50nM 크로만, 1.5μM 엠리카산, 1x 폴리아민 보충제 및 0.7μM trans-ISRIB(CEPT 칵테일)를 보충합니다(재료표 참조).
   2. 0.20μm 필터로 필터 멸균하고 4°C에서 최대 4주 동안 보관합니다.
6. 당겨진 유리 피펫을 준비합니다.
   1. 22.9cm(9인치) 유리 파스퇴르 피펫을 목 아래 ~2cm의 분젠 버너 위에 두 조각으로 당겨 얇은 면이 다른 쪽보다 ~4cm 짧은 두 개의 피펫을 만듭니다.
   2. 불꽃의 도움으로 당겨진 면의 끝을 구부려 부드러운 "r"을 만듭니다.
   3. 당겨진 피펫을 멸균을 위해 오토클레이브 슬리브와 오토클레이브에 넣습니다.
7. 소뇌 분화 배지(CDM)를 준비합니다.
   1. Iscove의 Modified Dulbecco's Medium(IMDM)과 Ham의 F12 영양 믹스를 1:1 비율로 섞습니다. 1x L-알라닌-L-글루타민 보충제, 화학적으로 정의된 지질 농축액 1%(v/v), 0.45mM 1-티오-글리세롤, 15μL/mL 아포-트랜스페린, 5mg/mL 소 혈청 알부민(BSA) 및 7μg/mL 인슐린(재료표 참조)으로 혼합물을 보충합니다.
   2. 0.20μm 필터로 필터 살균하고 4°C에서 보관하고 1개월 이내에 사용하십시오.
8. 소뇌 성숙 배지(CMM)를 준비합니다.
   1. 1x L-알라닌-L-글루타민 보충제 및 1x N-2 보충제로 neurobasal 배지를 보충합니다(재료 표 참조).
   2. 0.20μm 필터로 필터 멸균하고 4°C에서 보관하고 2주 이내에 사용하십시오.

2. 피더가 없는 iPSC 배양

1. 아래 단계에 따라 셀을 해동합니다.
   1. BMM 플레이트(단계 1.1)를 37°C 인큐베이터에 넣고 세포를 해동하기 전에 최소 1시간 또는 하룻밤 동안 겔화시킵니다.
   2. 10mL의 PSC 해동 매체(1.5단계)를 37°C에서 예열합니다.
   3. 세포가 있는 cryovial을 액체 질소에서 37°C의 수조로 옮깁니다.
      참고: 세포 배양 공간에서 오염원이 생성되는 것을 방지하려면 표준 수조를 사용하지 않는 것이 좋습니다. 대신, 작은 비커에서 담수를 37°C까지 가열하여 일회용 수조를 생성할 수 있습니다.
   4. 튜브에 작은 얼음 조각이 남아 있으면 수조에서 얼음을 제거하고 튜브를 건조시킨 다음 70% 에탄올을 분사합니다. 튜브를 후드로 옮기고 2mL 또는 5mL 혈청학 피펫(재료 표 참조)을 사용하여 세포를 15mL 원뿔형 튜브로 부드럽게 옮깁니다.
   5. 원뿔형 튜브를 소용돌이치면서 세포에 8mL의 PSC 해동 배지를 적반합니다. 200 x g에서 상온에서 5분 동안 원심분리기.
   6. 세포 펠릿을 방해하지 않고 진공 흡입기로 상층액을 조심스럽게 흡인합니다. PSC 해동 배지 2mL에 세포를 재현탁합니다.
   7. 플레이트에서 BMM을 흡인하고 균일한 분포를 위해 플레이트 전체에 재현탁 세포를 적음으로 추가합니다.
   8. 플레이트를 37°C, 5% CO₂의 인큐베이터에 놓습니다. 다음 날 PSC 배지로 매체를 새로 고칩니다. 그 후, 매체를 매일 교체하십시오.
2. 아래 단계에 따라 셀을 유지 관리합니다.
   1. 필요한 부피의 PSC 배지를 37°C에서 예열합니다(예: 35mm 플레이트당 배지 1mL).
   2. 플레이트에서 분화된 세포 또는 콜로니를 조사하고 당겨진 유리 피펫으로 분화된 세포를 제거합니다(단계 1.6).
      참고: iPSC 콜로니는 형태학적으로 동일한 세포를 가진 부드러운 가장자리를 가지고 있습니다.
   3. 사용한 매체를 매일 변경하고 3-4일마다 또는 70% 포화도에 도달했을 때 통과하십시오.
3. 세포를 통과시킵니다.
   1. 필요한 양의 BMM 플레이트를 최소 1시간 또는 하룻밤 동안 배양기에 넣은 후 통과시킵니다. 필요한 양의 PSC 배지를 37°C에서 예열합니다(1.3단계).
   2. 풀드 글라스 파이펫을 사용하여 분화된 세포나 콜로니를 청소합니다.
   3. 진공 흡입기로 사용한 배지를 흡입하고 35mm 접시당 1mL의 PSC 해리 배지를 추가합니다. 37 ° C에서 1-3 분 동안 배양하십시오 .
      참고: PSC 배지를 추가하기 전에 PSC 계대 살균 용액에서 콜로니가 이륙하면 배양 시간을 줄일 수 있습니다.
   4. PSC 패스시징 용액을 흡입하고 예열된 PSC 배지를 추가합니다.
   5. 멸균 200 μL 피펫 팁을 사용하여 한 방향으로 서로 평행하게 스크래치 라인을 만들고, 플레이트를 90° 회전한 다음, 이전 스크래치 라인과 수직으로 두 번째 스크래치 라인 세트를 만듭니다(플레이트를 가로질러 교차 해치 패턴 만들기).
   6. 세트 플레이트에서 BMM 솔루션을 흡입합니다. 혈청학 피펫을 사용하여 콜로니를 수집하고 새 BMM 플레이트에 분배합니다.
   7. 37 °C, 5 % CO₂ 에서 배양하십시오. 매체를 매일 교체하십시오.
4. 세포를 동결하십시오.
   1. 내용물에 라벨을 부착하여 극저온 살균제를 준비하고 후드의 자외선(UV) 아래에서 30분 동안 살균합니다(재료 표 참조).
   2. PSC 배지에 10%(v/v) DMSO를 보충하여 PSC 동결 배지를 준비합니다. 2.3.2-2.3.5 단계를 수행합니다.
   3. 5mL 혈청학 피펫과 원심분리를 사용하여 15mL 코니컬 튜브로 세포를 이동시키고 200 x g에서 RT에서 5분 동안 원심분리합니다.
   4. 배지를 조심스럽게 흡인하고 PSC 동결 배지에서 세포 펠릿을 재현탁합니다.
   5. cryovials로 분배합니다. 바이알을 냉동 용기에 넣고 용기를 -80°C 냉동고에 넣습니다.
   6. 다음 날, 장기 보관을 위해 냉동 연료를 액체 질소로 옮깁니다.

3. 소뇌 분화

참고: 분화를 시작하기 전에 iPSC는 6개의 35mm 접시로 배후를 거쳐 70% 포화도에 도달했을 때 분화를 위한 준비를 합니다. 각 35mm 플레이트는 6웰 플레이트의 한 웰로 이송됩니다.

1. 0일차에 EB 형성을 위해 건강한 iPSC 콜로니를 들어 올립니다.
   1. 10μM Y-27632 및 10μM SB431542(재료 표 참조)이 보충된 1mL의 CDM(1.7단계)을 6웰 ULA(Ultra-Low Attachment) 플레이트의 각 웰에 추가하고 들어올린 콜로니를 웰에 추가할 준비가 될 때까지 인큐베이터에 넣습니다.
   2. 당겨진 유리 피펫을 사용하여 분화된 세포를 세척합니다. 배지를 흡입하고 각 35mm 접시에 1mL의 PSC 계대 살균 용액을 추가합니다. 37°C에서 3분 동안 배양하고 흡인하고 10μM Y-27632 및 10μM SB431542.
      가 보충된 CDM 2mL를 추가합니다. 메모: CDM을 추가하기 전에 PSC 계대 살균 용액에서 콜로니가 들어올리면 배양 시간을 줄일 수 있습니다.
   3. 투과광 도립 현미경 아래에서 4배 배율을 사용하여 당겨진 유리 피펫의 구부러진 가장자리를 사용하여 집락을 부드럽게 들어 올립니다. 모든 콜로니를 들어 올리면 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 6웰 ULA 플레이트의 한 웰로 전체를 부드럽게 옮깁니다. 각 iPSC 플레이트에 대해 이 과정을 반복합니다. 37 ° C에서 5 % CO₂.
      로 세포를 배양합니다. 메모: 콜로니가 너무 크거나 병합된 경우 풀드 글라스 파이펫의 끝으로 슬라이스하여 더 작은 EB를 생성할 수 있습니다.
2. 2일차에 FGF2를 각 웰에 최종 농도 50ng/mL.
   까지 추가합니다. 메모: 소뇌 분화에 사용되는 FGF2는 열에 안정적이지 않습니다. 이 프로토콜은 열 안정성 FGF2로 테스트되지 않았습니다.
3. 7일째에 1/3 중간 변화를 합니다. 웰에 총 배지 3mL를 넣고 1,000μL 피펫터를 사용하여 사용한 배지 1mL를 부드럽게 흡입하고 새 CDM 1mL로 교체합니다. 7일 동안 EB를 배양합니다.
4. 14일차에 1,000 μL 피펫터를 사용하여 거의 모든 사용한 배지를 부드럽게 흡입합니다. EB의 손상을 최소화하려면 플레이트를 소용돌이쳐 플레이트 중앙에 모든 EB를 모은 다음 플레이트를 기울이고 가장자리에서 천천히 흡인합니다.
   1. 중간 양이 줄어들면 플레이트를 천천히 평평하게 놓고 계속 흡인합니다. EB가 건조되지 않도록 충분한 매체를 남겨 두십시오. 그런 다음 10μM Y-27632가 보충된 신선한 CDM 3mL를 추가합니다. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 EB를 PLO/라미닌 코팅 접시로 옮깁니다(1.2단계).
      메모: 다운스트림 애플리케이션에 따라 EB를 6웰 PLO/라미닌 플레이트로 옮기거나 단일 EB를 PLO/라미닌 코팅된 24웰 플레이트 또는 커버슬립의 단일 웰로 옮길 수 있습니다.
5. 15일째에 배지를 흡인하고 새 CDM.
   로 교체합니다. 메모: 시간이 지남에 따라 증발이 발생하므로 공급 사이에 충분한 매체를 확보하기 위해 웰에 충분한 배지를 추가하는 것이 중요합니다(예: 6웰 플레이트의 웰의 경우 배지 3mL 추가). 배지가 산성화되기 시작하면(투명하고 노란색으로 변함) 프로토콜이 끝날 때까지 공급 일정에 없더라도 배지를 새로 고칩니다.
6. 21일째에 사용한 배지를 흡인하고 CMM으로 교체합니다. 28일째에 새 CMM으로 매체를 변경합니다. 35일째에 추가 적용을 위해 세포를 수확합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10 mL 혈청학적 피펫	피셔 사이언티픽	13-678-26일
1-티오-글리세롤	시그마	M6145
2 mL 혈청학적 피펫	피셔 사이언티픽	13-678-26B
250mL 필터 장치, 0.2μm aPES, 50mm 직경	피셔 사이언티픽	FB12566502
35mm 이지 그립 티슈 클러처 디쉬	송골매	353001
5 mL 혈청학적 피펫	피셔 사이언티픽	13-678-25디
60mm 이지 그립 조직 배양 접시	송골매	353004
6웰 초저 부착 플레이트	코 닝	3471
9" 일회용 파스퇴르 피펫	피셔 사이언티픽	13-678-20디
아포 트랜스페린	시그마	T1147
소 혈청 알부민(BSA)	시그마	A9418
세포 배양 등급 물	싸이티바	SH30529.02
화학적으로 정의된 지질 농축액	지브코	11905031
크로만 1	케이맨	34681
클래스 II, 타입 A2, 생물학적 안전 캐비닛	주식회사 누에어레	NU-540-600	후드, 자외선
Costar 24웰 플레이트, TC 처리	코 닝	3526
Costar 6웰 플레이트, TC 처리	코 닝	3516
DMEM을 참조하십시오.	지브코	11965092
DMEM/F12	지브코	11320033
DMSO(디메슬리 설폭사이드)	시그마	D2438
DPBS+/+	지브코	14040133
엠리카산	케이맨	22204
Epi5 에피솜 iPSC 재프로그래밍(reprogramming) 키트	생명 기술	A15960
에센셜 8-플렉스	지브코	A2858501	열 안정성 FGF2를 가진 PSC 매체
소 태아 세럼 - 프리미엄 셀렉트	애틀랜타 바이오로직스	S11150
FGF2	페프로텍	100-18B
글루타맥스 보충제	지브코	35050061	L-알라닌-L-글루타민 보충제
Ham's F12 영양 믹스	지브코	11765054
HERAcell VIOS 160i CO2 인큐베이터	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	50144906
국제경영시스템(IMDM	지브코	12440053
인슐린	지브코	12585
라미닌 마우스 단백질	지브코	23017015
마트리겔 매트릭스	코 닝	354234	기저막 매트릭스
MEM NEAA	지브코	11140050
미니 원심분리기	랩넷 인터내셔널	C1310	탁상용 미니 원심분리기
N-2 보충제	지브코	제17502-048
Neurobasal 배지	지브코	21103049
PBS, pH 7.4	지브코	10010023
PFA 16%	전자 현미경 과학	15710
폴리아민 보충제	시그마	P8483
폴리-L-오르니틴(PLO)	시그마	3655
염화칼륨	시그마	746436
SB431542	시그마	54317
자체 밀봉 가능한 파우치를 통해 볼 수 있습니다.	스테리킹	SS-T2 (90x250)	오토클레이브 파우치
구연산나트륨 이수화물	피셔 사이언티픽	시즌 279-500
실린지 필터, sterile, PES 0.22 μm, 30 mm Dia	국제 리서치 제품	256131
트랜스 ISRIB	케이맨	16258
증기압 삼투압계	웨스코, Inc.	모델 5520	삼투압계
Y-27632	바이오젬	1293823

년 월 년 년 년 ) ) 년 호 년 (영문) 년 님 년