유도 만능 줄기 세포에서 소뇌 세포의 2D 단층을 생성하는 기술

초록

출처: Madencioglu, D. A., et al. 2D 구조에서 체외 인간 소뇌 발달 모델링.J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 인간 유도 만능 줄기 세포를 소뇌 전구 세포로 분화시키는 프로토콜을 보여줍니다. 여기에는 줄기세포 군체를 초저 부착 플레이트로 옮겨 배아체를 형성하고, 성장 인자로 분화를 촉진한 다음, 배아체를 접착을 위해 매트릭스 코팅된 플레이트로 옮기는 작업이 포함됩니다. 후속 단계에는 세포 이동을 유도하고 성숙 배지를 추가하여 글루타메이터 및 GABAergic 소뇌 신경 세포 전구체와 Purkinje 세포 전구체의 발달을 안내하는 것이 포함됩니다.

프로토콜

1. 실험적 준비

1. 기저막 매트릭스(BMM) 코팅 플레이트를 준비합니다.
   메모: BMM은 따뜻한 온도에서 더 빨리 응고됩니다. 플레이트는 신속하게 준비하고 즉시 4°C에 보관해야 합니다.
   1. BMM(재료 표 참조)을 얼음 위에서 4°C에서 최소 2시간 동안 또는 밤새 해동합니다.
   2. Dulbecco의 Modified Eagle Medium(DMEM)/F12 및 BMM을 최종 농도 80μg/mL로 혼합합니다. 조직 배양 접시(35mm 접시의 경우 1mL, 60mm 접시의 경우 2mL)에 BMM 용액을 분배하고 세포를 도금하기 전에 37°C에서 최소 1시간 동안 또는 밤새 배양합니다.
      알림: 사용하지 않은 접시는 4 °C에서 2 주 동안 보관할 수 있습니다.
2. 폴리-L-오르니틴/라미닌(PLO/라미닌) 코팅 플레이트를 준비합니다.
   1. 멸균 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS+/+)에 20μg/mL PLO(재료 표 참조)를 준비하고 6웰 플레이트의 각 웰에 1mL를 추가합니다. 인큐베이터에서 37 °....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10 mL 혈청학적 피펫	피셔 사이언티픽	13-678-26일
1-티오-글리세롤	시그마	M6145
2 mL 혈청학적 피펫	피셔 사이언티픽	13-678-26B
250mL 필터 장치, 0.2μm aPES, 50mm 직경	피셔 사이언티픽	FB12566502
35mm 이지 그립 티슈 클러처 디쉬	송골매	353001
5 mL 혈청학적 피펫	피셔 사이언티픽	13-678-25디
60mm 이지 그립 조직 배양 접시	송골매	353004
6웰 초저 부착 플레이트	코 닝	3471
9" 일회용 파스퇴르 피펫	피셔 사이언티픽	13-678-20디
아포 트랜스페린	시그마	T1147
소 혈청 알부민(BSA)	시그마	A9418
세포 배양 등급 물	싸이티바	SH30529.02
화학적으로 정의된 지질 농축액	지브코	11905031
크로만 1	케이맨	34681
클래스 II, 타입 A2, 생물학적 안전 캐비닛	주식회사 누에어레	NU-540-600	후드, 자외선
Costar 24웰 플레이트, TC 처리	코 닝	3526
Costar 6웰 플레이트, TC 처리	코 닝	3516
DMEM을 참조하십시오.	지브코	11965092
DMEM/F12	지브코	11320033
DMSO(디메슬리 설폭사이드)	시그마	D2438
DPBS+/+	지브코	14040133
엠리카산	케이맨	22204
Epi5 에피솜 iPSC 재프로그래밍(reprogramming) 키트	생명 기술	A15960
에센셜 8-플렉스	지브코	A2858501	열 안정성 FGF2를 가진 PSC 매체
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국제경영시스템(IMDM	지브코	12440053
인슐린	지브코	12585
라미닌 마우스 단백질	지브코	23017015
마트리겔 매트릭스	코 닝	354234	기저막 매트릭스
MEM NEAA	지브코	11140050
미니 원심분리기	랩넷 인터내셔널	C1310	탁상용 미니 원심분리기
N-2 보충제	지브코	제17502-048
Neurobasal 배지	지브코	21103049
PBS, pH 7.4	지브코	10010023
PFA 16%	전자 현미경 과학	15710
폴리아민 보충제	시그마	P8483
폴리-L-오르니틴(PLO)	시그마	3655
염화칼륨	시그마	746436
SB431542	시그마	54317
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