Generating Neurons and Glial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Embryoid Bodies

초록

출처: Pistollato, F., et al. 신경 독성 테스트를 위해 인간 유도 만능 줄기 세포를 뉴런과 신경교세포의 혼합 배양으로 분화하기 위한 프로토콜. J. Vis. 특급(2017년)

이 비디오는 배아체(EB)를 신경 상피 응집체로 분화하고 이후 신경 세포와 신경교세포로 분열하는 과정을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 in vitro에서 신경 세포 및 신경교세포를 효율적으로 생성할 수 있으며, 이는 독성 테스트를 위한 테스트 시스템 역할을 할 뿐만 아니라 신경 독성과 관련된 다양한 경로를 평가할

수 있습니다.

프로토콜

1. HiPSC의 혼합 뉴런과 신경교세포로의 분화

참고: 이 절차를 완료하는 데 약 28일이 소요되며 주요 단계는 그림 1에 요약되어 있습니다.

1. 배아체(EB)의 생성 (0일 → 1일)
   참고: 이 절차에는 우수한 수동 기술과 정밀도가 필요합니다. HiPSC(human induced pluripotent stem cells, 인간 유도 만능 줄기 세포) 집락 단편은 다음 단계에서 균질한 배아체(EB)를 얻기 위해 동일한 크기여야 합니다. 형태학적으로 분화된 콜로니(큰 세포질 분획과 작은 핵체를 가진)는 폐기해야 합니다.
   1. 멸균 조건에서 미분화 hiPSC 콜로니(직경 약 1mm, 그림 2A 참조)를 절단하기 전에 hiPSC 배지(3mL/60mm 페트리 접시)를 새로 고칩니다.
   2. 30G 바늘이 있는 1mL 주사기를 사용하여 미분화된 집락(그림 2A 및 그림 2B 참조)을 약 200μm x 200μm의 단편으로 자릅니다. 실온의 층류 캐비닛에서 4X 배율의 실체 현미경을 사용합니다.
   3. 200μL 피펫을 사용하여 아래에 있는 배지를 부드럽게 피펫팅하여 조각을 들어 올려 접시 표면에서 콜로니 조각을 분리합니다.
   4. 1, 2 또는 5 mL 피펫을 사용하여 분리된 모든 단편과 배지를 15-mL 튜브로 옮깁니다.
   5. 모든 단편을 회수하기 위해 2mL의 완전한 hiPSC 배지로 접시를 헹굽니다.
   6. 112 x g에서 1분 동안 원심분리기
   7. 상층액을 흡입하고 완전한 hiPSC EB 배지 5mL에 단편을 부드럽게 재현탁합니다(재료 표 참조).
   8. 60mm 초저 부착 페트리 접시(5mL/60mm 페트리 접시)에 집락 조각을 플레이트에 넣습니다.
   9. 페트리 접시를 37 ° C와 5 % CO₂에서 밤새 배양합니다.
   10. 다음 날(1일차)에 1, 2 또는 5mL 피펫을 사용하여 15mL 튜브에 EB와 배지를 수집합니다.
   11. EB를 112 x g에서 1분 동안 원심분리합니다.
   12. 상등액을 조심스럽게 흡인하고 1, 2 또는 5mL 피펫을 사용하여 5mL의 완전한 hiPSC EB 배지에 EB를 부드럽게 재현탁합니다.
   13. EB를 새로운 60mm 초저 부착 페트리 접시(5mL/60mm 페트리 접시)에 다시 놔둡니다.
   14. 페트리 접시를 37 ° C와 5 % CO₂에서 밤새 배양합니다.
2. 1일차에는 기저막 매트릭스(예: matrigel, 이하 "표준 매트릭스"라고 함) 또는 기타 적절한 단백질 기질(예: 라미닌)로 접시를 코팅합니다.
   1. 차가운 1.5 mL 튜브와 차가운 5 또는 10 mL 피펫을 사용하여 -80 °C의 200-μL 분취액에 표준 매트릭스(재료 표 참조)를 보관합니다.
   2. 얼음 위에서 표준 매트릭스 200μL를 해동합니다.
   3. 20mL의 기저(DMEM/F12) 배지(1:100 희석)에 200μL의 표준 매트릭스를 희석합니다.
   4. 60mm 페트리 접시에 이 용액(5mL/접시)을 코팅합니다.
   5. 코팅된 접시를 37°C에서 밤새 배양합니다.
      메모: 이 접시는 EB(약 50EB/접시)를 플레이트하고 신경 상피 응집체(로제트)를 생성하는 데 사용됩니다. 1.3단계를 참조하십시오.
3. 신경 상피 응집체(로제트)의 생성(2일 → 7일)
   1. 2일차에 60mm 페트리 접시에서 표준 매트릭스 코팅 용액을 제거하고(플레이트를 헹굴 필요 없음) 접시당 5mL의 완전한 신경 상피 유도 배지(NRI)로 채웁니다. 재료 표를 참조하십시오.
   2. 실체 현미경으로 4배 배율로 200μL 피펫을 사용하여 플로팅 EB(1.1.14단계)를 코팅된 접시(~50EB/접시)로 옮기고 층류 캐비닛에 넣습니다.
      메모: 균질한 중간 크기의 EB(직경 ~200-300μm)를 선택하는 것이 중요합니다. 너무 작은 EB는 신경외배엽 분화 과정에서 잘 생존하지 못할 수 있으며, 너무 큰 EB는 코어 괴사를 겪는 경향이 있습니다.
   3. 접시를 37 ° C 및 5 % CO₂에서 배양합니다.
   4. 다음 날(3일차)에는 10배 배율로 현미경으로 접시를 확인하여 EB가 모두 부착되어 있는지 확인합니다.
   5. 완전한 NRI 배지로 전체 매체 변경을 부드럽게 수행합니다.
   6. 신경상피 응집체(로제트)가 보여야 하는 7일째까지 격일로 NRI 배지를 변경합니다.
   7. 7일차에 1.2단계에서 설명한 대로 표준 매트릭스(또는 라미닌)를 필요한 플레이트 또는 접시 형식(96웰 플레이트(100μL/웰), 24웰 플레이트(250μL/웰), 12웰 플레이트(500μL/웰), MEA 칩(전기 활성용, 1mL/단일 웰 칩) 또는 60mm 페트리 접시(4mL/접시)에 코팅합니다.
   8. 코팅된 플레이트/접시를 37°C 및 5% CO₂에서 최소 2시간 동안 배양합니다.
4. 로제트 해리 및 신경 분화 (8 일 → 28 일)
   참고: 이 절차에는 우수한 수동 기술과 정밀도가 필요합니다. 중배엽 및 내배엽 세포가 수집되지 않도록 하려면 외배엽 장미와 같은 구조만 해리 및 수집해야 합니다.
   1. 8일차에 멸균 상태에서 10X 배율로 실체 현미경으로 장미와 같은 구조를 조각으로 자릅니다. 1G 바늘이 있는 30mL 주사기를 사용합니다. 로제트는 바늘로 쉽게 만졌을 때 접시에서 분리되는 경향이 있습니다.
   2. 200μL 피펫을 사용하여 로제트 조각의 분리를 완료합니다.
   3. 접시를 층류 후드 아래로 옮기고 1, 2 또는 5mL 피펫을 사용하여 로제트 조각과 그 배지를 15mL 원뿔형 튜브에 수집합니다. 모든 조각을 회수하기 위해 2mL의 NRI 배지로 접시를 헹굽니다.
   4. 로제트 조각을 112 x g에서 2분 동안 회전시킵니다.
   5. 상층액을 흡인합니다.
   6. 1mL의 1x DPBS(칼슘 및 마그네슘 제외)에 펠릿을 부드럽게 재현탁하고 1,000μL 피펫을 사용하여 로제트 조각을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 부분적으로 해리합니다.
   7. 4mL의 완전한 NRI 배지를 추가하고 트리판 블루와 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다(재료 표 참조)
      메모: 20μL의 세포 현탁액을 20μL의 Trypan blue에 희석합니다. 이 단계는 세포를 단일 세포 현탁액으로 가져올 수 없는 경우 생략될 수 있습니다. 로제트 단편이 완전히 해리된 것처럼 보이지 않는 경우, 약 50 EBs/60-mm 접시에서 유래한 로제트 단편을 50mL의 완전한 NRI 배지에 재현탁시키고 표 1에 표시된 대로 플레이팅할 수 있습니다.
   8. 페트리 접시, 플레이트 및/또는 MEA 칩에서 표준 매트릭스(또는 라미닌) 코팅 용액을 흡인합니다(1.3.7단계). 건조시키지 마십시오.
   9. 연구 계획에 따라 완전한 NRI 배지에 세포를 플레이트화합니다(약 15,000 cells/cm², 도금 부피 표시는 표 1 참조).
   10. 플레이트를 37 ° C 및 5 % CO₂에서 밤새 배양합니다.
   11. 10일째에, 완전한 신경 분화 배지(ND)를 사용하여 전체 매체 변화를 수행한다; Table of Materials를 참조하라.
   12. 28일까지 일주일에 두 번씩 전체 ND 매체를 새로 고칩니다.

표 1.

해리된 로제트 도금 밀도에 대한 참고 사항: 로제트 단편이 완전히 해리된 것처럼 보이지 않는 경우 약 15.000 cells/cm2의 세포 도금 밀도에 도달하기 위해 약 50 EBs/1 x 60mm 접시에서 파생된 해리된 로제트 단편을 완전한 NRI 배지 50mL에 재현탁하고 다음과 같이 도금할 수 있습니다(플레이트 형식에 따라 다름).

웰 개 개 웰 개 개 분 개 조 의

멀티웰 플레이트/MEA	성장 면적 (cm2 / well)	웰당 플레이트에 대한 세포 현탁액의 부피(또는 MEA 칩)	도금할 수 있는 최대 플레이트 수(50ml의 세포 현탁액 포함)
96	0.3	100 ul	5
48 웰	0.7	220 ul	4
24	2	625 ul	3
12 웰	4	1.25 밀리리터	3
6 웰	10	3.125 밀리리터	2
단일 웰 MEA 칩	3.5	1.1 밀리리터	45

결과

그림 1: Neuronal Differentiation Protocol의 개략도. (상부) IMR90-hiPSC 집락은 배아체(EB)를 형성하기 위해 단편으로 절단할 수 있습니다. 시험관 내(in vitro, DIV) 2일 후, EB를 라미닌 또는 표준 매트릭스 코팅 접시에 도말하고 신경 상피 유도(NRI) 배지가 있는 곳에서 배양하여 신경 외배엽 유도체(로제트, 여기서는 nestin(녹색) 및 β-III-tubulin(빨간색)으로 염색됨)을 생성할 수 있습니다. 로제트는 라미닌 또는 표준 매트릭스 코팅 접시에서 해리, 수집 및 재도금할 수 있으며, 신경 분화(ND) 배지가 있는 상태에서 성숙한 신경세포(NF200, 빨간색) 및 신경교세포(GFAP, 녹색) 세포로 추가로 분화할 수 있습니다. (하부) 로...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
hiPSC EB 배지:
녹아웃 DMEM	써모 피셔	제10829-018	(단계 2.1.7)
녹아웃 세럼 대체품(KOSR)	써모 피셔	제10828-028	20% 최종 농도 (단계 2.1.7)
비필수 아미노산	써모 피셔	제11140-035	(단계 2.1.7)
페니실린/스트렙토마이신	써모 피셔	15140-122	50 U/mL 최종 농도 (단계 2.1.7)
L-글루타민 200mM 용액	써모 피셔	제25030-081	2 mM 최종 농도 (단계 2.1.7)
β-메르캅토에탄올	써모 피셔	우편번호 31350-010	50 μM 최종 농도 (단계 2.1.7)
완전한 신경 상피 유도 배지(NRI):
DMEM/F12	써모 피셔	Tel.: 3133-038	(단계 2.3.1)
비필수 아미노산	써모 피셔	제11140-035	(단계 2.3.1)
N2 보충제	써모 피셔	제17502-048	(단계 2.3.1)
페니실린/스트렙토마이신	써모 피셔	15140-122	50 U/mL 최종 농도 (단계 2.3.1)
헤파린 등급 I-A, ≥180 USP 단위/mg	시그마-알드리치	H3149-100구	2 μg/ml 최종 농도 (단계 2.3.1)
bFGF	써모 피셔	제13256-029	사용 전 20ng/ml 최종 농도 첨가(단계 2.3.1)
Matrigel 베이스먼트 멤브레인 매트릭스	코 닝	354234	1:100 (단계 2.2). Matrigel을 얼음에서 해동하고 200ul 부분 표본을 준비하여 -80°C에 보관합니다. 코팅의 경우 200ml의 차가운 DMEM/F12 배지에 200ul 부분 표본을 희석합니다.
라미닌	시그마-알드리치	엘2020	1:100 (단계 2.2). PBS 1X에 희석합니다.
완전한 신경 분화 배지(ND):
Neurobasal 배지	써모 피셔	21103049	(단계 2.4.11)
B-27 보충제 (50개)	써모 피셔	17504044	(단계 2.4.11)
N2 보충제	써모 피셔	제17502-048	(단계 2.4.11)
페니실린/스트렙토마이신	써모 피셔	15140-122	50 U/mL 최종 농도 (단계 2.4.11)
지그엔프	써모 피셔	PHC7045	1 ng/ml 최종 농도. 사용 전에 첨가합니다. (단계 2.4.11)
증권 시세	써모 피셔	PHC7074	2.5 ng/ml 최종 농도. 사용 전에 첨가합니다. (단계 2.4.11)

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