Culturing and Maintaining Dopaminergic Neurons from Mouse Embryonic Brain Tissue

초록

출처: Weinert, M. et al., 배아 설치류 뇌에서 1차 중뇌 도파민성 뉴런의 격리, 배양 및 장기 유지. J. Vis. 특급 (2015)

이 비디오는 쥐의 배아 뇌 조직에서 도파민 뉴런을 배양하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 과정에는 단백질 분해 효소로 중뇌를 치료하고, 세포를 분리하고, 세포의 성장과 장기적인 생존을 위해 항생제가 함유된 영양이 풍부한 배지의 폴리머 코팅된 커버슬립에서 배양하는 것이 포함됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 복부 중뇌 세포의 해리

1. 복부 중뇌(ventral midbrain)의 조각들을 층류 후드(laminar flow hood) 아래로 옮깁니다. Hanks의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)을 제거하고 예열된 1ml(37ºC) 0.05% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(트립신-EDTA)을 원뿔형 튜브(최대 12개의 복부 중뇌 조각에 충분한 부피)에 추가합니다. 조직을 37ºC에서 5-10분 동안 배양합니다.
2. 후드 아래의 트립신-EDTA를 제거하고 조직에 1ml의 비활성화 배지(세럼이 트립신을 비활성화함)를 추가합니다.
3. 비활성화 매체를 제거하고 전체 배지 1ml에서 조직을 두 번 씻습니다.
   메모: 해리된 세포가 버려지는 것을 방지하려면 튜브에서 모든 배지를 제거하고 조직을 피펫팅하지 마십시오.
4. 1ml의 완전한 배지를 추가하고 불에 닦인 유리 피펫으로 조직을 분쇄합니다. 기포 형성을 피하고 단일 세포 현탁액이 달성될 때까지 계속 분쇄합니다.
   참고: 일반적으로 완전한 해리를 위해서는 제한된 팁을 8-10번 통과해야 합니다.
5. 실온(RT)에서 5분 동안 400 x g의 세포를 원심분리하고 배지를 제거합니다.
6. 펠릿을 1ml 완전 매체에 최대 4회까지 천천히 위아래로 피펫팅하여 다시 현탁시킵니다.

2. 배쪽 중뇌 세포 도금

1. 10μl의 세포 현탁액과 90μl의 Trypan blue 용액을 혼합하고 혈구계로 세포 수를 계산합니다.
   메모: 세포의 생존 가능성도 이 단계에서 확인할 수 있습니다.
2. 멸균된 마이크로 원심분리기 튜브 캡을 100mm 페트리 접시에 놓고 집게를 사용하여 폴리-L-오르니틴/라미닌 코팅된 커버슬립을 캡 위에 한 번에 하나씩 옮깁니다.
   메모: 커버슬립을 세척하지 말고 라미닌을 건조시키지 마십시오., 이는 불균일한 배양을 유발하고 세포의 생존력을 감소시킬 수 있습니다.
3. 각 커버슬립 위에 완전한 배지와 100μl(총 150,000개 셀)의 셀 현탁액을 추가하여 부피를 1μl당 1,500셀로 조정합니다(부피는 유출 없이 커버슬립 표면을 덮는 것이 최적임). 페트리 접시를 닫고 가습된 조직 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에서 1시간 동안 배양합니다.
   메모: 중요 단계: 이 단계는 세포의 부착 및 생존력을 향상시키고 배아당 커버슬립 수를 증가시키는 데 필요합니다. 또는 세포를 웰(커버슬립 포함)로 직접 옮길 수 있지만 세포 수는 웰당 150,000개 대신 350,000개로 늘려야 합니다. 즉, 이 방법을 사용하면 8-10개의 커버슬립을 얻을 수 있는 반면, 직접 전달은 플레이트(커버슬립 옆 또는 아래)에 부착되는 셀로 인해 약 3-4개의 커버슬립을 얻을 수 있습니다. 이 방법을 사용한 배양의 평균 생존 가능성은 약 90%였습니다.

3. 문화의 성장과 유지

1. 배양 1시간 후, 배지를 포함한 커버슬립을 400μl의 예열된(최대 37ºC) 완전한 배지(총 부피: 500μl)가 포함된 24웰 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다. 37ºC에서 밤새도록(O/N) 세포를 배양합니다.
2. 웰 배양 후 24시간 이내에 각 웰에 500μl의 완전한 배지를 부드럽게 추가합니다
   참고: 처음 몇 시간은 도파민 뉴런의 생존에 가장 중요한 단계이며, 살아남은 세포의 수는 이 시점 이후에는 크게 변하지 않습니다.
3. 처음 2주 동안 또는 배지가 노란색이 될 때까지 배양액에 배지를 추가하지 마십시오. 2주 이상 배양하거나 중간 색상이 노란색으로 변하는 경우 배지의 절반(500μl)을 신선하고 완전한 예열 배지(일반적으로 2주마다)로 교체하십시오.
   메모: 배양 내의 도파민 뉴런은 이러한 조건에서 6주 이상 생존할 것입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dulbecco의 변형 된 독수리 중간 영양 혼합물 F-12	인비트로젠	11330
행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)(1X), 액상	인비트로젠	제24020-117
소 태아 혈청, 발열 불활성(FBS)	인비트로젠	16140
N2 보충제(100X), 액상	인비트로젠	제17502-048
D-(+)-포도당 용액(물 중 45%(wt/vol)	시그마	G8769 (영문
소 혈청 알부민 BSA	시그마	A9430
Engelbreth-HolmSwarm 쥐 육종 기저막의 라미닌	시그마	엘2020
페니실린/스트렙토마이신	인비트로젠	15070
트립신(0.05% (wt/vol)	인비트로젠	25300
소 혈청 알부민(BSA) 세포 배양 테스트 완료	시그마	A9418
인산염 완충 식염수(PBS)	시그마	P3813
폴리 L- 오르 니틴, 0.01 % 용액	시그마	P4957
트리판 블루 용액 (0.4% (wt/vol))	바이오휘태커	17-942E

년 호 년 호 ) 년 년 (영문)