확산성 내인성 폰틴 신경교종(Diffuse Intrinsic Pontine Glioma)으로부터 세포 분리 및 배양(Isolating and Culturing Cells from Diffuse Intrinsic Pontine Glioma)

초록

출처: Lin, G. L. et al., 미만성 내인성 폰틴 신경교종(DIPG)의 신속한 사후 세포 배양을 위한 프로토콜.J. Vis. 특급 (2017)

이 비디오는 미만성 내인성 폰틴 신경교종 또는 DIPG에 영향을 받은 뇌간 조직에서 신경교전구세포를 분리하고 배양하는 과정을 보여줍니다. 효소 소화를 통해 종양 조직에서 분리된 신경교세포는 신경기저 배지에서 배양되어 성장과 자유롭게 떠다니는 신경구의 발달을 촉진합니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 조직 샘플 얻기

참고: 이 프로토콜의 중요한 구성 요소는 부검 시점 즉시 조직 기증을 적절하게 처리해야 합니다. 전체 검체 생존 가능성은 PMI(Post-Mortem Interval)를 최소화하고, 조직을 항생제/항진균제가 보충된 적절한 저온 매체로 즉시 옮기고, 운송 내내 검체를 젖은 얼음 위에 보관하고, 프로토콜 전반에 걸쳐 멸균 기술을 유지하는 데 크게 좌

우됩니다.

1. 기증이 임박했다는 통지를 받으면 샘플 수집 키트를 준비합니다. 조직 샘플의 반송 운송에 직접 사용할 수 있는 절연 용기가 있는 배송 상자를 사용하여 다음 재료를 포함하십시오.
   1. 멸균 장갑, 커튼 및 메스를 포함한 멸균 준비용 재료를 포함합니다.
   2. 30mL 운송 매체가 들어 있는 8 - 10개의 멸균 50mL 원뿔형 튜브를 얼음 또는 냉팩과 함께 절연 용기에 포함합니다.
      메모: 모든 표준 세포 배양 배지가 작동할 수 있지만, 항생제/항진균제가 첨가된 Hibernate-A를 사용하면 최상의 시료 생존력을 얻을
   수 있습니다.
   3. 다른 분석을 위한 추가 샘플 튜브(예: 고정제)를 포함합니다.
   4. 조사관의 현장에서 부검을 수행하지 않을 경우 종양 샘플을 수집하는 방법을 명확하게 설명하는 문서를 포함하십시오. 여기에는 무균 상태 유지, 샘플 튜브를 젖은 얼음 위에 보관, 종양 세포가 종종 이 영역을 침범하기 때문에 중뇌 및 수질의 샘플을 포함하는 것과 같은 세부 사항이 포함됩니다.
2. 부검 중 불임을 유지하십시오. 두개골 내부의 뇌가 멸균된 것으로 간주하므로 두개골이 열리면 멸균 기술(장갑 교체 포함)을 관찰하십시오. 피부와 모발로 인한 오염을 피하는 것이 중요합니다.
3. 복부 쪽(폰즈의 "배", 그림 1 참조)에서 종양을 절개합니다. 멸균 메스로 종양에서 1cm의 작은 덩어리를 잘라내고 즉시 저온 운송 매체(1.1.2단계의 참고 참조)에 넣고 젖은 얼음에 넣습니다. 각 튜브에 10mL의 조직을 배치하여 각 튜브에 40mL의 조직 및 매체의 최종 부피를 얻습니다.
   메모: 미만성 내인성 폰틴 신경교종(DIPG)의 경우, 종양은 폰스와 종종 뇌간의 나머지 부분에 확산적으로 침투합니다. 따라서 일반적으로 폰에서 3 - 4 개의 튜브 (30 - 40 mL 조직)와 중뇌 및 수질에서 각각 1 - 2 개의 튜브 (10 - 20 mL 조직)를 포함하여 가능한 한 많은 샘플을 수집하십시오.
4. 종종 많은 종양 세포를 포함하는 폰즈(pons)와 나란히 배치된 중뇌와 수질에서 샘플을 수집합니다.
5. 샘플 채취 후 단열 용기에 담긴 젖은 얼음에 샘플을 하룻밤(O/N) 배송합니다. 얼면 세포가 죽을 수 있으므로 샘플을 드라이아이스에 담아 배송하지 마십시오.

2. 샘플 처리 준비

1. 시료 전처리를 시작하기 전에 면도날, 곡선형 지혈기 및 기타 비멸균 도구와 함께 조직 배양 후드를 자외선(UV) 아래에서 1시간 동안 멸균합니다. 배양물의 오염을 방지하기 위해 멸균 조건에서 다음 단계를 모두 수행합니다.
2. 필터 용액을 준비하고 멸균합니다.
   1. 1.8M 자당 용액을 준비하려면 300mL 증류수에 308.07g의 자당을 용해시킵니다. 칼슘이나 마그네슘이 없는 50mL 10x Hank's-buffered Saline Solution(HBSS)을 넣고 증류수를 사용하여 총 부피를 500mL로 만듭니다. 4 °C에서 보관하십시오.
   2. 효소 분해 용액을 준비하려면 다진 조직 10mL당 칼슘 및 마그네슘이 함유된 HBSS 50mL를 취하고 500μL 5mg/mL 데옥시리보뉴클레아제 I(최종 농도 50μg/mL), 500μL 2.5mg/mL 콜라겐분해효소 I/II 및 디스페이아제 용액(최종 농도 25μg/mL)을 추가합니다. 및 500 μL 1 M 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) 완충액. 소화 용액을 37°C 수조에서 예열합니다.
   3. 종양 줄기 배지(TSM) 염기를 준비하기 위해 250mL Neurobasal-A, 250mL Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12(DMEM/F12), 5mL 100x 항생제-항진균제, 5mL 200mM L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드(GlutaMAX-A), 5mL HEPES 완충액, 5mL 100mM 피루브산 나트륨 및 5mL 100x MEM 비필수 아미노산을 혼합합니다.
   4. 성장 인자를 가진 완전한 TSM을 준비하려면, TSM 베이스에 다음 보충제를 추가하십시오: 50x B27 보충제 - 비타민 A (1:50), 인간 표피 성장 인자 (H-EGF, 20 ng/mL), 인간 섬유아세포 성장 인자 (H-FGF, 20 ng/mL), 인간 혈소판 유래 성장 인자 AA (H-PDGF-AA, 10 ng/mL), 인간 혈소판 유래 성장 인자 BB (H-PDGF-BB, 10 ng/mL) 및 헤파린 용액 (2 μg/mL).
3. 스윙 버킷 로터가 장착된 실험실용 원심분리기를 4°C로 예냉각합니다.

3. 기계적 해리

1. 조직을 벽이 높은 100mm x 20mm 세포 배양 접시에 옮깁니다. 배송에서 남은 배지를 제거하고 10 - 15 mL의 저온 배양 배지로 교체하십시오.
2. 구부러진 지혈기를 사용하여 면도날을 잡고 조직을 잘게 다지면서 명백한 혈관이나 수막을 제거합니다.
   메모: 최종 조직 조각은 1mm보다 작아야 합니다(그림 2B 참조).
3. 조직을 깨끗한 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 세포 배양 접시를 추가로 5mL의 저온 배양 배지로 세척하고 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 남은 조직을 옮기기 위해 필요에 따라 이 세척 단계를 반복합니다.
4. 10 mL 혈청학적 피펫을 사용하여 부드럽게 분쇄합니다(4 - 5회). 더 큰 조직 조각이 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 필요한 경우 샘플을 1분(350 x g, 4°C) 동안 짧게 원심분리합니다.
5. 기계적으로 해리된 분수를 수집합니다.
   1. 상층액을 제거하고 100μm 필터를 통해 "기계적 분해"라고 표시된 새로운 50mL 원뿔형 튜브로 여과합니다. 필터를 원래 원뿔형 튜브 위로 뒤집고 배양 배지로 세척하여 조직 조각을 회수합니다.
   2. "기계적 해리" 분획을 5분(350 x g, 4°C) 동안 원심분리합니다.
   3. 펠릿화된 "기계적 해리" 분획에서 상등액을 제거하고 조직을 저온 배양 배지에 재현탁시킵니다. "기계적 해리" 원뿔형 튜브에 5mL 이상의 조직이 있는 경우 조직을 다른 50mL 원뿔형 튜브로 분할하여 튜브에 5mL 이상의 조직이 없도록 합니다.
6. 기계적으로 해리된 분획을 자당 구배 원심분리 단계까지 얼음 위에 보관합니다(5단계). 대안적으로, 기계적으로 해리된 분획은 효소 해리 잠복기 동안 5단계로 진행할 수 있습니다(4.4단계).

4. 효소 해리

1. 나머지 더 큰 조직 단편이 들어 있는 튜브에 5mL 이상의 조직이 있는 경우 5mL 이상의 조직을 가진 튜브가 없도록 조직을 다른 50mL 원뿔형 튜브로 분할합니다.
2. 나머지 조직 조각이 들어 있는 원뿔형 튜브를 5분(350 x g, 4°C) 동안 원심분리합니다.
3. 상등액을 제거하고 예열된 효소 분해 용액을 추가하여 조직 1mL당 5mL 분해 용액이 있도록 합니다(예: 5mL 조직에 대해 25mL 분해 용액).
4. 원뿔형 튜브 뚜껑을 실험실 필름으로 밀봉하고 37°C의 회전기에서 30분 동안 반응을 배양합니다.
5. 배양 후 샘플을 부드럽게 분쇄합니다(그림 2C 참조).
   1. 10 mL 혈청학적 피펫을 사용하여 샘플을 위아래로 6 - 8회 피펫팅합니다. 과도한 기포가 발생하지 않도록 하십시오.
   2. 피펫 끝에 1,000 μL 피펫 팁을 추가하고 추가로 6 - 8회 분쇄합니다.
   3. 남은 덩어리가 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 100μm 필터를 통해 세포가 여전히 부유한 상층액을 제거하고 여과하여 "Enzymatic Dissociation"이라고 표시된 새로운 50mL 원추형 튜브에 넣고 얼음에 보관합니다.
   4. 중요한 조직 단편이 남아 있는 경우 칼슘과 마그네슘이 함유된 HBSS 10mL를 단편에 추가로 추가하고 3.5.1 및 3.5.2 단계를 반복합니다. 이 최종 용액을 100μm 필터를 통해 "Enzymatic Dissociation" 튜브로 여과합니다.
6. "Enzymatic Dissociation" 튜브를 5분(350 x g, 4°C) 동안 원심분리하고 자당 그래디언트 원심분리를 계속합니다.

5. 자당 구배 원심분리

1. 샘플이 여전히 용액에 부유되어 있는 경우 5분(350 x g, 4°C) 동안 원심분리합니다.
2. 상층액을 제거하고 칼슘과 마그네슘이 없는 20mL의 차가운 HBSS에 조직을 재현탁합니다. 차가운 HBSS로 총 최대 25mL의 용량을 제공합니다.
3. 25mL 1.8M 자당 용액을 천천히 넣고 튜브를 뒤집어 섞습니다. 그 결과 0.9M 자당 구배가 생성됩니다.
4. 10분 동안 브레이크 없이 원심분리기(800 x g, 4°C). 원심분리 브레이크를 사용하면 그래디언트가 중단되고 수율이 감소합니다(원심분리 전후의 시료 예는 그림 2D 참조).
5. 미엘린 파편과 가능한 한 많은 자당 용액을 조심스럽게 흡인합니다. 칼슘과 마그네슘이 없는 차가운 HBSS 30mL를 넣고 부드럽게 섞어 샘플을 세척합니다. 5분 동안 원심분리기(350 x g, 4°C).

6. ACK 적혈구 용해

1. 세척 상층액을 제거합니다. 5mL ACK 용해 완충액을 추가하고 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁시키면서 RT에서 1분 동안 튜브를 소용돌이칩니다.
2. 칼슘과 마그네슘이 없는 30mL의 차가운 HBSS를 첨가하여 용해를 담금질합니다.
3. 5분 동안 원심분리기(350 x g, 4°C).

7. 초기 배양 유지 관리

1. 성장 인자와 함께 10 - 15 mL 따뜻하고 완전한 TSM에서 최종 세포 펠릿을 재현탁하고 trypan blue exclusion을 사용하여 혈구세포분석기에서 생존 가능한 세포 밀도를 정량화합니다.
   메모: 생존 가능한 세포의 범위는 조직 기증의 상황에 따라 크게 달라지며, 남은 세포 파편으로 인해 초기 단계에서 정량화가 어려울 수 있습니다. 이상적인 경우 샘플당 100만 개의 살아있는 세포를 확보하는 것을 목표로 합니다. 과도한 파편이 남아 있는 경우 T175 플라스크에서 더 낮은 밀도로 플레이트합니다.
2. 최종 세포 현탁액을 새로운 T75 배양 플라스크로 옮깁니다. 전반적인 성장 인자 수준을 유지하고 종양 세포 신경구의 발달을 모니터링하기 위해 격일로 추가 성장 인자를 급증시킵니다(그림 2E 및 그림 3 참조).

결과

그림 1. 폰틴 종양의 부검 샘플. 미만성 내인성 폰틴 신경교종(diffuse intrinsic pontine glioma)의 즉각적인 사후 소견. 종양은 교두의 복부 표면에 크고 수초가 풍부한 덩어리로 나타납니다.

그림 2. 다양한 처리 단계에서 조직 샘플.(A) 멸균 부검 절차와 젖은 얼음에 익일 배송하여 샘플을 얻습니다. (B) 왼쪽에서 오른쪽으로: (1행) 선적 매체에 종양 조직을 포함하는 튜브...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
최대 절전 모드-A	지브코	A12475-01
칼슘/마그네슘을 함유한 HBSS	지브코	제24020-117
HBSS (하이브에스)	코 닝	21-022-이력서
헤페스	지브코	제15630-080
리베아제 DH (콜라겐분해효소/디스파제)	로슈	5401054001
DNAse I	워딩턴 생화학	LS002007
자당	시그마	S0389
항생제/항진균제	지브코	제15240-096
뉴로베이스알-A	지브코	제10888-022
DMEM/F12	지브코	제11330-032
글루타맥스-I (100배)	지브코	제35050-061
피루브산나트륨 (100mM)	지브코	제11360-070
B27 보충제 - 비타민 A	지브코	제12587-010
MEM 비필수 아미노산 (100X)	지브코	제11140-050
인간 PDGF-AA	셰넌도어 생명공학	100-16
인간 PDGF-BB	셰넌도어 생명공학	100-18
인간 EGF	셰넌도어 생명공학	100-26
인간 FGF	셰넌도어 생명공학	100-146
멸균 메스 블레이드	음유시인 페이커	372610
곡선형 지혈기	정밀 과학 도구	13013-14
면도날	폭스바겐	55411-050
100 x 20mm 세포 배양 접시	코 닝	353003
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