Spinal Cord Neural Progenitor Cells를 Motor Neuron으로 분화

초록

출처: Taga, A. et al., 지역별 인간 만능 줄기세포 유래 성상세포 및 뉴런으로 ALS를 모델링하기 위한 전기생리학적 플랫폼 구축. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 척수 신경 전구 세포(NPC)를 운동 뉴런으로 구별하는 방법을 보여줍니다. NPC가 성숙한 운동 뉴런으로 분화하는 것을 촉진하기 위해 특정 억제제가 풍부한 특수 배지를 사용하여 코팅된 배양 플레이트에서 NPC의 배양 과정을 자세히 설명합니다.

프로토콜

1. 신경전구세포(NPC) 배양 해동

1. 세포를 해동하기 전날 폴리오르니틴(PLO)과 라미닌으로 10cm 플레이트를 코팅합니다.
   1. 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 증류수(dH₂O)에 100μg/mL로 희석된 PLO 5mL를 플레이트에 추가합니다. 37 ° C에서 최소 1 시간에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
   2. PLO 용액을 흡입하고 PBS로 플레이트를 세 번 헹굽니다. (PLO는 제대로 세척하지 않으면 독성이 있습니다.)
   3. PBS에 희석된 라미닌을 10μg/mL 농도로 PLO 코팅된 플레이트에 첨가합니다. 37 °C에서 최소 1 시간 동안, 가급적이면 하룻밤 동안 배양하십시오. 배양 후 헹구지 않고 라미닌 용액을 흡입하여 세포 접착력을 향상시킵니다.
      메모: 플레이트는 미리 PLO로 코팅하고, 물로 세 번 세척하고, 멸균 후드에서 건조하고, 4°C에서 보관할 수 있습니다.
2. 각 10cm 세포 배양 플레이트에 대해 6 x 10⁶ cells/바이알을 포함하는 하나의 NPC 바이알을 해동합니다.
3. 액체 질소에서 NPC cryotube를 제거하고 즉시 37°C 수조에 최대 2분 동안 넣고 액체로 둘러싸인 작은 얼음 조각이 될 때까지 바이알을 흔들어 빠르게 해동합니다.
4. 1000 μL 피펫을 사용하여 세포 응집체를 15 mL 원뿔형 튜브로 옮기고 최대 15 mL의 예열된 신경 분화 배지(NDM) 또는 Dulbecco's Modified Eagles Medium(DMEM) / Ham의 F21 F12 보충제를 추가하여 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 희석합니다.
5. 300 x g에서 5분 동안 원심분리기
6. 상층액을 흡인하고, 세포 펠릿을 모터 뉴런(MN) 분화 배지(표 1) + ROCK-I(20μM)로 재현탁하고, 1000μL 피펫을 사용하여 단일 세포 현탁액이 얻어질 때까지(최대 5회) 상하로 분쇄합니다.
7. 단일 셀 현탁액을 PLO-Laminin 코팅된 10cm 플레이트로 옮깁니다.
8. 플레이트를 인큐베이터로 옮기고 적절한 세포 접착을 위해 밤새 방해받지 않고 그대로 두십시오.

2. 척수 NPC를 운동 뉴런으로 분화하기

1. 1.1-1.8단계에서 언급한 대로 초기 단계를 수행하되 최종 배지는 MN 분화 배지 + ROCK-I(20μM)입니다.
2. 도금 다음 날, ROCK-I가 없는 MN 분화 배지와 배지를 완전히 교환한 다음 격일로 배지를 교체합니다. 주말 동안 금요일에 세포를 공급하고 월요일에 다시 세포를 공급합니다. 세포 파편을 제거하기 위해 필요한 경우 PBS로 세포를 헹굽니다.
3. MN 분화 배지 + 시토신 아라비노시드(ARA-C)(0.02 μM)로 배지를 변경하고 신경교세포(glial committed progenitors)가 세포 클러스터에 응집된 유사분열 후 MN 전구세포(post-mitotic MN progenitors) 아래에서 단일 증식 편평한 세포로 나타날 때 48시간 동안 배양합니다.
   메모: 일반적으로 이는 초기 도금 후 첫 7일 이내에 발생하지만 세포주에 따라 변동성이 있을 수 있습니다.
4. 48 시간 후, ARA-C를 함유 한 배지를 흡인하고, PBS로 배양물을 부드럽게 3 회 헹구고, 배지를 ARA-C가없는 신선한 MN 배지로 변경한다.
5. ARA-C로 치료한 후, 격일(또는 월요일, 수요일, 금요일)에 한 번씩(또는 월요일, 수요일, 금요일) 배지 교환을 수행하여 신경 세포 클러스터의 조기 박리를 방지하기 위해 진공 흡입기 대신 수동 피펫으로 기존 배지를 제거합니다. 또한 일주일에 한 번 Laminin 1 μg/mL로 MN 배지를 농축하여 배양 플레이트에 대한 신경 세포 부착을 더욱 향상시킵니다.

표 1: 배양 배지

중간 이름	시약	농도
신경 분화 매질(NDM)	Neurobasal L-글루타민 비필수 아미노산 보충 N - N2 보충 페니실린/스트렙토마이신	1x 100x 100x 100x 100배
운동 뉴런 분화 매체	신경 분화 매체 아스코르브산 푸로모르파민 뇌 유래 신경 영양 인자 섬모 신경 영양 인자 인슐린 유사 성장 인자 1 신경교세포주 유래 신경영양인자 레티노산 화합물 E 보충제 B - B27 보충제	1x 0.4 μg/mL 1μM 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL 1μM 125 nM 50배

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10cm 멸균 배양 플레이트	송골매	353003
비필수 아미노산(NEAA)	써모피셔	11140050	작업 농도 100x
보충제 N - N2 보충제	써모피셔	17502048	작업 농도 100x
L-글루타민	써모피셔	25030	작업 농도 100x
뉴로기저	써모피셔	21103049	작업 집중 1x
레티노산(RA)	시그마	R2625	100mg을 3.3mL의 DMSO에 용해시켜 100mM의 원액을 얻습니다. 스톡 100 μL/튜브를 분주하고 -80ºC에서 동결합니다. 200μL의 100mM 스톡을 취하고 10배(DMSO 1.8mL 추가)를 희석하여 10mM 스톡을 만듭니다. 50 μL/튜브를 분취하고 -80 ºC에서 보관합니다. 사용을 위해 1:10000으로 희석합니다. (작업 농도 2 μM).
폴리오르니틴(PLO)	시그마-알드리치	P3655	ddW 1mL에 100mg을 녹여 100mg/mL 원액을 얻습니다. 100 μL 튜브에 스톡을 분주합니다. (작업 농도 100 μg/mL)
라미닌	써모피셔	23017-015	원액 1 mg/mL, 작업 농도 10 μg/mL(코팅), 1 μg/mL(세포 매체)
아스코르브산(ASAC)	시그마	A4403	100mg을 250mL의 dH2O에 녹이면 0.4mg/ml의 스톡을 얻을 수 있습니다. 0.22μm 필터를 통한 멸균 필터, 부분 표본 및 -80ºC에서 동결, 1:1000으로 희석하여 사용합니다. (작동 농도 0.4 μg/mL).
섬모 신경 영양 인자(CNTF)	페프로텍	450-13	100μg을 멸균 PBS 1mL에 용해시킨 다음 멸균 0.1% BSA-PBS 9mL를 10μg/mL에 첨가합니다. -80ºC에서 분취 및 동결. 사용을 위해 1 : 1000에서 희석하십시오. (작업 농도 10ng/mL).
컴파운드 E	아브캠	ab142164	250μg을 2.0387mL의 DMSO에 용해시켜 250μM 스톡을 얻습니다. -80ºC에서 부분 표본 및 동결. 사용을 위해 1:2000으로 희석합니다. (작업 농도 125 nM).
DMEM/F12	써모피셔	113300	작업 집중 1x
신경교세포주 유래 신경영양성(GDNF)	페프로텍	450-10	PBS 1mL에 100μg을 100μg/mL로 용해한 다음 멸균 0.1% BSA-PBS 9mL를 10μg/mL에 첨가합니다. -80ºC에서 분취 및 동결. 사용을 위해 1 : 1000에서 희석하십시오. (작업 농도 10ng/mL).
ROCK-I 개요	페프로텍	1293823	1480μL의 dH2O에 5mg을 용해시켜 10mM 스톡을 얻고 분취 및 -80ºC에서 동결합니다. 1:500으로 희석하여 사용합니다. (작업 농도 20 μM).
펜슬린/스트렙토마이신	써모피셔	15140122	작업 농도 100x
푸르모르파민(PMN)	밀리포어-시그마	540223	9.6mL의 DMSO에 5mg을 용해시켜 1mM 용액을 얻습니다. -80ºC에서 분취 및 동결. 사용을 위해 1:1000으로 희석합니다. (작업 농도 1 μM).
재조합 인간 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF)	페프로텍	450-02	재구성 전 잠시 원심분리기. PBS 1mL에 100μg을 100μg/mL로 용해한 다음 멸균 0.1% BSA-PBS 9mL를 10μg/mL에 첨가합니다. -80ºC에서 분취 및 동결. 사용을 위해 1 : 1000에서 희석하십시오. (작업 농도 10ng/mL).
인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF-1)	R&D 시스템	291-G1-200	PBS 2mL에 200μg을 100μg/mL로 녹인 다음 0.1%BSA-PBS 18mL를 추가하여 10μg/mL 스톡을 만들고 -80ºC에서 보관합니다. -80ºC에서 분취 및 동결. 10μg/mL 스톡을 1:1000으로 희석하여 사용합니다. (작업 농도 10ng/mL).
신경교세포주 유래 신경영양성(GDNF)	페프로텍	450-10	PBS 1mL에 100μg을 100μg/mL로 용해한 다음 멸균 0.1% BSA-PBS 9mL를 10μg/mL에 첨가합니다. -80ºC에서 분취 및 동결. 사용을 위해 1 : 1000에서 희석하십시오. (작업 농도 10ng/mL).
레티노산(RA)	시그마	R2625	100mg을 3.3mL의 DMSO에 용해시켜 100mM의 원액을 얻습니다. 스톡 100 μL/튜브를 분주하고 -80ºC에서 동결합니다. 200μL의 100mM 스톡을 취하고 10배(DMSO 1.8mL 추가)를 희석하여 10mM 스톡을 만듭니다. 50 μL/튜브를 분취하고 -80 ºC에서 보관합니다. 사용을 위해 1:10000으로 희석합니다. (작업 농도 2 μM).
컴파운드 E	아브캠	ab142164	250μg을 2.0387mL의 DMSO에 용해시켜 250μM 스톡을 얻습니다. -80ºC에서 부분 표본 및 동결. 사용을 위해 1:2000으로 희석합니다. (작업 농도 125 nM).
보충제 B - B27 보충제	써모피셔	21985023	작업 농도 50x
멸균 세포 배양 후드	베이커 컴퍼니	SG-600
탁상용 세포 배양 원심분리기	써모피셔	75004261	소르발 레전드 X1R
물목욕	써모피셔	2332	아이소템프
습도 조절식 세포 배양 인큐베이터	써모피셔	370	37ºC, 5% CO2로 설정

년 (영문) 년 의 대답 년 년 년 년 년 시리즈 년 의