Isolating and culturing murine Cerebellar Granular Neuron Progenitors(쥐 소뇌 과립 뉴런 전구 세포)

초록

출처: Bovio, P., et al., Isolation and Cultivation of Neural Progenitors followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark. J. Vis. 특급. (2018년)

이 비디오는 쥐 새끼의 소뇌에서 소뇌 신경 전구 세포의 격리와 배양을 보여줍니다. 소뇌 과립 뉴런 전구세포는 차등 접착을 통해 분리 및 정제되어 성상세포를 효과적으로 제거합니다. 이러한 배양된 전구세포는 이후에 소뇌 과립 뉴런으로 분화합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 준비

사항

1. CGNP(소뇌 과립 뉴런 전구 세포) 분리를 위한 준비
   1. 소뇌를 분리하기 위해 P5-P7 동물을 생성하기 위해 마우스의 적절한 짝짓기를 조직합니다(ChIP 및 조건당 3-5마리).
   2. HBSS 완충액에 6mg/mL 포도당을 첨가하여 HBSS/포도당을 준비합니다.
   3. DMEM-F12에 1%(v/v) N2 보충제, 1%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신-네오마이신, 25mM KCl 및 10% FCS를 첨가하여 CGNP 세포 배양 배지(CGM)를 준비합니다. CGNP 배양을 위해 FCS가 없지만 0.6μg/mL 음파 고슴도치(SHH)(CGM-SHH)를 포함하는 CGM 배지를 준비하고 필요한 경우 37°C로 평형을 이룹니다.
   4. 신경교세포 제거를 위해 RT에서 1-2시간 동안 100μg/mL 폴리-D-라이신으로 6-well 세포 배양 플레이트를 코팅합니다. 그 후 멸균 ddH₂O로 두 번 세척하고 플레이트를 건조시킵니다. 플레이트를 4 °C에서 최대 1주일 동안 보관하십시오.
   5. CGNP 배양을 위해 6-well 세포 배양 플레이트를 4°C에서 하룻밤 동안 폴리-L-오르니틴(0.1mg/mL)으로 코팅합니다. 그 후, 세포 배양을 위해 H₂O로 두 번 세척하고 플레이트를 건조시킵니다 .
      메모: 플레이트는 4°C에서 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다.
   6. HBSS/포도당에서 0.025% 트립신(w/v)을 준비하고 필요한 경우 37°C로 평형을 이룹니다.
2. 뇌 조직의 신경 전구 세포 분리
   1. CGNP(소뇌 과립 뉴런 전구세포)의 격리 및 선택적 배양
      1. P5-7 동물을 가위를 사용하여 참수하여 안락사시킵니다. 두피 피부를 제거하고 두개골을 연 다음 작은 가위와 집게를 사용하여 뇌를 제거합니다. 소뇌를 분리하여 얼음처럼 차가운 HBSS/포도당으로 옮깁니다. 모든 수막과 혈관을 제거하고 소뇌를 차가운 HBSS/포도당으로 채워진 15mL 튜브로 옮깁니다.
      2. 10mL의 얼음처럼 차가운 HBSS/포도당으로 소뇌를 3회 세척하고(4°C에서 5분 동안 650 x g에서 원심분리로 수집) 1mL 피펫으로 위아래로 부드럽게 피펫팅하여(최대 2-3회) 소뇌를 균질화하여 0.5-1mm³ 단편을 얻습니다.
      3. HBSS/글루코스에 0.025% 트립신 5mL를 첨가하고 37°C 수조에서 15분 동안 지속적으로 저으면서 조직을 배양합니다. CGM 5mL를 첨가하여 분해를 중지하고 4°C에서 5분 동안 650 x g에서 원심분리하여 조직을 수집합니다.
      4. 상층액을 제거하고 1mL CGM에서 1mL 피펫 팁으로 조직을 분쇄한 후 새 15mL 튜브로 옮깁니다.
         메모: 기포를 피하는 것이 중요합니다.
         1. 5mL CGM을 추가하고 혼합물을 얼음에서 2분 동안 배양하여 조직 잔여물을 가라앉힙니다. 상층액을 새 15mL 튜브로 옮깁니다. 잔류 조직에 2mL CGM을 추가하고 분쇄 절차를 반복합니다.
      5. 상층액(조직 잔해물 제외, 총 약 10mL)을 풀링하고 650 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 소뇌 세포를 수집합니다. 펠릿을 10mL CGM에 재현탁합니다.
      6. 성상세포는 CGNP보다 폴리-D-라이신에 더 빠르고 강하게 부착하기 때문에 100μg/mL 폴리-D-라이신으로 코팅된 6-웰 플레이트(웰당 최대 4mL)에 세포를 플레이트화하고 37°C에서 20분 동안 배양하여 성상세포를 제거합니다.
      7. 플레이트를 흔들어 상층액을 모으십시오. 그런 다음 15mL 튜브에서 650 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 10mL CGM에 재현탁하고 Neubauer 계수 챔버로 세포를 계수합니다.
         메모: CGNP는 둥글고 작으며 위상차 현미경을 사용하여 이미지화할 때 후광을 보여줍니다.
      8. 필요한 경우 폴리-L-오르니틴 코팅 플레이트(6웰당 3 x 10⁶개 셀)에 37°C 예열 CGM에서 셀을 파종하고 37°C, 5% CO₂ 및 100% 상대 습도에서 배양합니다.
         메모: 플레이트에 CGM을 남겨두면(그리고 FBS와 함께) CGNP가 소뇌 과립 뉴런(CGN)으로 분화됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
B27 보충제 (50x)	생명 기술	17504044	카테고리: 세포 배양 약어/주석: CCM의 경우
DMEM-F12	생명 기술	제11320-033	카테고리: 세포 배양 약어/주석: CGM의 경우
소태아세럼 10% (v/v)	지브코	10082147	카테고리: 세포 배양 약어/주석: For CPC isolation and CGM
포도당	시그마-알드리치	G5767	카테고리: 세포 배양 약어/주석: For CGNP isolation
글루타티온 (1.25 mg/ml)	시그마-알드리치	G4251	카테고리: 세포 배양 약어/주석: CCM의 경우
글리신	칼 로스	3187	카테고리: ChIP 약어/코멘트: For cell fixation
Hank's Balanced Salt 솔루션	생명 기술	14025-100	카테고리: 세포 배양 약어/주석: HBSS
L-글루타민(200mM)	생명 기술	25030081	카테고리: 세포 배양 약어/주석: CCM의 경우
라미닌	시그마-알드리치	엘2020	카테고리: 세포 배양 약어/코멘트: CPC culturing을 위해
N2 보충제	생명 기술	17502048	카테고리: 세포 배양 약어/주석: CGM의 경우
Neurobasal 배지	지브코	21103049	카테고리: 세포 배양 약어/주석: CCM의 경우
페니실린-스트렙토마이신-네오마이신 1% (v/v)	생명 기술	15640055	카테고리: 세포 배양 약어/주석: PSN, CCM 및 CGM
인산염 완충 식염수	생명 기술	10010023	카테고리: 세포 배양 약어/주석: PBS, for CPC isolation
폴리-D-라이신	시그마-알드리치	P6407	카테고리: 세포 배양 약어/주석: For CGNP isolation
폴리-L-오르니틴 하이드로브로마이드	시그마 알드리치	P3655	카테고리: 세포 배양 약어/코멘트: CPC culturing을 위해
염화칼륨	써모 피셔	AM9640G	카테고리: 세포 배양 약어/주석: KCl, CGM용
소닉 고슴도치(SHH)	시그마-알드리치	SRP6004	카테고리: 세포 배양 약어/주석: For CGNP isolation
슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(1mg/ml)	시그마-알드리치	S7571	카테고리: 세포 배양 약어/주석: CCM의 경우
트립신-EDTA 0,05% (w/v)	시그마 알드리치	59417씨	카테고리: 세포 배양 약어/주석: CPC 격리용

호 년 (영문)