인간 만능 줄기 세포에서 스페로이드 생성

초록

출처: Shaker, M. R., et al. 체외 뇌 신경 노화 모델링을 위한 강력하고 재현성이 높은 피질 뇌 오가노이드 생성. J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 인간 만능 줄기 세포(hPSC)가 구형 뇌 오가노이드로 변형되는 과정을 보여줍니다. 특정 억제제를 사용함으로써 hPSC는 신경 계통으로 분화하도록 유도되어 신경 외배엽 군체를 형성합니다. 그런 다음 특수 성장 인자를 도입하여 군체의 자기 조직화와 증식을 촉진하여 궁극적으로 구형 뇌 오가노이드의 형성으로 이어집니다.

프로토콜

1. 피질 뇌 오가노이드 생성(그림 1)

참고: 프로토콜의 이 섹션에 있는 모든 단계는 달리 명시되지 않는 한 클래스 2 생물 안전 후드에서 발생합니다.

1. 인간 만능 줄기 세포(hPSC)에서 2D 신경외배엽 집락 유도 2D 배양(-1-3일)
   1. 유도 전에 인간 배아 줄기 세포(hESC) 자격을 갖춘 기저막 매트릭스의 hPSC 콜로니를 20%-30% 밀도의 6웰 플레이트에 플레이트합니다. 60% 포화도의 6웰 플레이트의 1웰에서 6웰 플레이트의 3웰로 hPSC 콜로니를 통과시켜 이러한 밀도를 달성합니다.
   2. 기저막 매트릭스 코팅의 경우, 기저막 매트릭스를 일반 기저 매체에서 1:50의 비율로 희석합니다. 6웰 플레이트의 1mL/웰을 골고루 침전하고 실온(RT)에서 1시간 동안 배양한 다음 흡인합니다.
   3. 분화 전에 2mL의 무혈청 세포 배양 배지에서 1일 동안 hPSC 집락을 유지합니다.
   4. hPSC 분화 당일, 검출 가능한 분화가 없는 건강한 집락을 확인하기 위해 4배에서 10배 배율로 명시야 현미경을 사용하여 hPSC 집락을 검사합니다.
      메모: 건강한 hPSC는 큰 핵, 매우 작은 세포질 및 두드러진 핵을 가진 세포로 촘촘한 가장자리 군체를 형성합니다. 분화된 iPSC 집락은 위에서 설명한 hPSC 집락과 뚜렷한 형태학적 차이를 보이며, 특히 집락의 바깥쪽 가장자리 주위 또는 중앙에서 그렇습니다.
   5. 표 1에 나열된 시약을 추가하여 분화에 필요한 N2 배지를 구성합니다. 사용하기 전에 이 매체를 RT로 가져오십시오.
   6. RT에서 6-well 플레이트의 각 well에서 무혈청 세포 배양 배지를 흡인하고 5mL 혈청학 피펫으로 부드럽게 첨가된 2mL의 N2 배지로 교체합니다.
   7. Decapentaplegic (SMAD) 억제제에 대한 이중 산모 억제제, SB-431542 (10 μM) 및 LDN 193189 (100 nM)을 추가합니다.
      메모: SMAD 억제제는 배지를 각 웰에 배치한 후 N2 배지에 첨가하거나 무혈청 세포 배양 배지를 대체하기 전에 필요한 양의 N2 배지에 첨가할 수 있습니다. 억제제는 플레이트를 부드럽게 소용돌이치거나 배지와 억제제를 포함하는 튜브를 3-4회 뒤집어 배지에 균일하게 통합될 수 있습니다.
   8. 다음 2일 동안 SB-431542(10μM) 및 LDN 193189(100nM)이 보충된 새로운 N2 배지를 매일 각 웰에 추가합니다.
      메모: SB-431542 및 LDN 193189 화합물을 용해하고 세포 독성을 방지하는 데 사용되는 Dimethyl sulfoxide(DMSO)에 세포의 장기간 노출을 줄이기 위해 신선한 N2 배지를 추가합니다.
2. 유도된 2D 신경외배엽 집락에서 3D 신경외배엽 스페로이드 생성(3-7일차)
   1. 1.2.2-1.2.8 단계에 따라 dispase를 사용하여 유도된 신경외배엽 집락을 들어 올립니다.
   2. 먼저 6-well 플레이트에서 2mL의 N2 배지를 제거하고 HBSS로 1x를 세척하여 모든 N2 배지가 제거되었는지 확인합니다.
      메모: N2 배지는 dispase의 효소 활성을 방해하여 우물에서 신경외배엽 집락이 적절하게 분리되는 것을 방지할 수 있습니다.
   3. 각 콜로니 함유 웰에 2.4 unit/mL dispase 1mL를 추가합니다.
   4. 37 °C에서 20-25 분 (최대 30 분) 동안 우물을 배양하십시오.정기적으로 식민지 분리를 확인하십시오.
      메모: 작은 군체는 20분 이내에 분리될 수 있습니다. 30분 후에도 갇혀 있는 콜로니는 무시해야 합니다.
   5. 배양 후 웰에 N2 배지 1mL를 추가하여 디스페이아제 효소의 활성을 중지하고 광경 P1000 피펫 팁 또는 멸균 가위로 절단한 변형된 P1000 피펫 팁(광경 P1000 팁으로 만들기)을 사용하여 콜로니를 15mL 튜브로 옮깁니다.
   6. 군체 덩어리가 중력으로 튜브 바닥으로 가라앉도록 합니다.
      메모: 이 과정은 약 1분 정도 소요됩니다.
   7. 덩어리가 가라앉으면 표준 P1000 피펫 팁으로 상층액을 조심스럽게 제거하고 1mL의 새 N2 배지로 교체합니다. 이 세척 단계를 세 번 반복하여 dispase.
      를 완전히 제거합니다. 메모: 남아 있는 디스페이즈는 신경외배엽 스페로이드의 균일한 형성을 방지하고 세포 사멸을 유도합니다.
   8. 세척 후 세포 응집을 3mL의 N2 배지에 재현탁시키고 6웰 플레이트의 한 웰로 옮기고 40ng/mL의 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 추가합니다.
      메모: 많은 수의 신경외배엽 집락이 분리되면 이러한 집락은 스페로이드 융합을 방지하기 위해 6웰 플레이트의 두 개 이상의 웰에 걸쳐 도금될 수 있습니다. 군체를 분산시킨 후 24시간 후에 스페로이드가 형성되었는지 확인합니다.
   9. 다음 3-4일 동안 동일한 배지에서 스페로이드를 유지하되 매일 각 웰에 새로운 bFGF(40ng/mL)를 추가하여 신경외배엽 세포 증식, 자가 조직화를 촉진하고 신경 상피를 유도 및 확장합니다.
      메모: 스페로이드가 더 높은 밀도로 도금된 경우 배지가 노랗게 변할 수 있으며 2일마다 새 bFGF(40ng/mL)로 교체해야 합니다. 그러나 이는 권장되지 않으며 대신 이 문제를 방지하기 위해 각 웰에서 더 적은 수의 스페로이드를 유지해야 합니다. 스페로이드는 신경상피가 명백한 경우 3일 후에 기저막 매트릭스에 내장될 수 있습니다. 신경 상피가 뚜렷하지 않거나 강해 보이지 않으면 스페로이드를 하루 더 유지하고 다시 확인하십시오.

표 1: N2 중간. 이 표에는 N2 배지를 준비하는 데 필요한 시약이 나열되어 있습니다.

미디어 구성 요소	농도
DMEM 영양 혼합물 F12 10x 500 mL (DMEM/F-12)
N2 보충제 5 mL (100x)	1% 공급
B 27 보충제 10mL	2% 보충
MEM 비필수 아미노산 용액(100개)	1%로 보충
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)	1%로 보충
2-메르캅토에탄올 50 mL(1000x )	0.1%로 보충

결과

그림 1: 재현 가능한 피질 뇌 오가노이드를 생성하기 위한 개략도. 피더가 없는 배지에서 유지되는 hPSC로부터 피질 뇌 오가노이드를 생성하기 위한 실험 절차의 개략적인 작업 흐름. 이 워크플로우는 2D hPSC를 오가노이드의 3D 패턴화된 피질 플레이트 인간 조직으로 구별하는 것과 관련된 6단계에 대한 개요를 제공합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
16% 포름알데히드(W/V) 메탄올 무함유	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	28908	PFA의 4%는 1x PBS에 희석됩니다.
2-메르캅토에탄올 50 mL(1000x)	라이프 테크놀로지스 오스트레일리아(TFS)	21985023	NM 및 DM 미디어에 사용
B 27 보충제 10mL	라이프 테크놀로지스 오스트레일리아(TFS)	17504044	NM 및 DM 미디어에 사용
SC50 카메라가 장착된 CKX53 현미경	올림푸스
Corning Costar 6웰 세포 배양 플레이트	시그마 알드리치 Pty Ltd	CLS3516-50개
Dispase II 파우더	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	17105041	분말을 HBSS에 용해시키고 0.22μm 필터를 통해 여과한 다음 10mL에서 분취하고 -20°C에서 보관
DMEM 영양 혼합물 F12 10x 500 mL (DMEM/F-12)	써모피셔	11320082	NM 및 DM 미디어에 사용
DMSO 디메틸 설폭사이드	시그마 알드리치 Pty Ltd	D2650-100ML
Dulbecco의 인산염 완충 식염수	시그마 알드리치 Pty Ltd	D1408-500ML
Falcon Matrigel hESC 인증 매트릭스	체외 기술 Pty Ltd	FAL354277	100 μL의 분취점을 만들고 -20 °C에서 보관
글루타맥스 보충제 100x	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	35050061	NM 및 DM 미디어에 사용
행크스 밸런스드 솔트 솔루션	시그마 알드리치 Pty Ltd	H8264
인간 유도 만능 줄기 세포(EU79)			피부 섬유아세포에서 재해석한 사내
인간 유도 만능 줄기 세포(G22)	유전자 바이오 셀		Genea Biocells(미국 샌디에이고)에서 획득
인간 유도 만능 줄기 세포(WTC)			브루스 콘클린 교수의 선물
InSolution TGF-Β RI 키나아제 억제제 VI, SB431542	머 크	US1616464-5MG
인슐린 용액 인간 재조합	시그마 알드리치 Pty Ltd	I9278	NM 및 DM 미디어에 사용
LDN193189 디하이드로클로라이드	시그마 알드리치 Pty Ltd	SML0559-5MG	차별화 중에 사용
MEM 비필수 아미노산 용액(100개)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	11140050	NM 및 DM 미디어에 사용
mTeSR 플러스	스템셀 기술	제100-0276	NM 배지로 분화하기 전에 hiPSC 집락을 유지하는 데 사용됩니다
N2 보충제 5 mL (100x)	생명 기술 호주 Pty Ltd	17502048	NM 및 DM 미디어에 사용
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	15140122	NM 및 DM 미디어에 사용
재조합 인간 FGF 염기성	R&D 시스템	233-FB-01엠	부분 표본은 20 μg/mL로 만들어지며 -20 °C에서 보관
SB431542	토크리스	1614	차별화 중에 사용
초저 부착성 멀티웰 플레이트, 24웰 플레이트, 폴리스티렌	시그마 알드리치 Pty Ltd	CLS3473-24개

) 년 ) 합니다. ) ) 호 . ) 됩니다. 년