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검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 해부 재료, 배양 배지, 미세 유체 장치 준비
- 오토클레이브 미세해부 겸자와 가위(121°C, 살균시간: 20분)를 멸균용기에 보관합니다.
- 유리 커버 슬립 (24mm x 24mm)을 37 ° C의 오비탈 쉐이커에서 24 시간 동안 1M HCl에서 배양하여 멸균합니다. 멸균 증류 된 H2O로 세 번 세척하고 에탄올 99 %로 세 번 세척합니다. 그런 다음 커버슬립을 37°C 또는 멸균 흐름 후드 아래에서 건조시킵니다. 마지막으로, 커버슬립을 고압멸균하거나 자외선(30분)에 노출시켜 살균을 완료합니다. 그런 다음 커버 슬립을 에탄올 70 %에 보관할 수 있습니다.
- 멸균 집게를 사용하여 패키지에서 AXIS Axon Isolation Devices를 조심스럽게 제거하고 멸균 페트리 접시에 넣습니다.
- 멸균 생검 펀치(ø: 1mm)를 사용하여 배양 챔버에 따라 배양할 샘플당 하나의 구멍을 만듭니다(그림 1).
메모: 가해지는 압력에 의해 손상될 수 있으므로 미세 홈에 너무 가까이 펀칭하지 마십시오.
- AXIS Axon Isolation Device를 에탄올 70%에 담가 살균합니다. 그런 다음 AXIS Axon Isolation Devices와 커버슬립을 멸균 흐름 후드 아래에서 완전히 건조시킵니다. 계속하기 전에 최소 3시간 동안 기다리십시오.
메모: 불완전한 건조는 미세유체 장치의 조립에 결함이 발생할 수 있습니다.
- 각 커버슬립을 35mm 페트리 접시에 넣거나 6웰 플레이트 안의 우물에 넣습니다.
- AXIS Axon Isolation Device를 커버슬립에 놓고 끝이 구부러진 집게로 부드럽지만 단단히 눌러 절연 장치와 유리 커버슬립이 완전히 접착
되도록 합니다.
- 각 배양 챔버에서 150 μl의 poly-D-lysine(멸균, 증류된 H2O에서 0.1 mg/ml)을 피펫으로 만듭니다. 미세유체 장치를 진공 상태에서 5분 동안 놓아 배양실에서 모든 공기를 제거합니다.
- 챔버 내에서 공기가 여전히 보이면 poly-D-lysine 용액을 챔버에 다시 피펫팅합니다.
- 37 ° C에서 poly-D-lysine O / N으로 장치를 배양하십시오.
- 멸균 증류 된 H2O로 챔버를 세 번 세척하십시오.
- 챔버를 150μl 라미닌 작업 용액(Sigma-Aldrich, 5μg/ml, 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 무혈청 배지)으로 채우고 37°C에서 O/N을 배양합니다.
- 다음 구성으로 삼차신경절 배양을 위한 배지 50ml를 준비합니다: 48ml Neurobasal 배지, 1ml B-27, 100U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 2mM L-글루타민, 5ng/ml 신경 성장 인자(NGF), 0.25pM 시토신 아라비노시드.
- 다음 조성으로 치아 배아배양을 위한 배지 50ml를 준비합니다: 40ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)-F12, 10ml 소 태아 혈청(FBS, 최종 농도: 20%), 100U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 2mM L-글루타민, 150μg/ml 아스코르브산.
2. 쥐 배아 생성 및 해부
- 질 플러그(질 플러그: 배아 발달일 0.5, E0.5)를 기준으로 배아 나이를 결정하고 형태학적 기준을 통해 확인합니다. 이 프로토콜의 경우 일반적으로 E14.5-E17.5 마우스 배아를 사용합니다.
- 해부 영역과 입체경을 에탄올 70%로 청소합니다.
- 자궁경부 탈구를 통해 임산부를 희생시킨다. 그리드의 첫 번째 손가락과 두 번째 손가락 사이에 마우스의 목을 놓고 단호하게 꼬리를 당깁니다.
- 하복부 주위의 피부를 절개하고 가위로 복부를 엽니다. 자궁 찾기: 임신 말기에 자궁은 복강을 풍부하게 채웁니다.
- 자궁을 절개하여 얼음 위에 PBS를 채운 튜브에 넣습니다. 얼음 위에 있을 때 조직은 몇 시간 동안 그대로 둘 수 있습니다. 산모의 시신은 제도적 지침에 따라 폐기한다.
- 자궁에서 배아를 해부하고 배아 외 조직에서 배아를 제거합니다. PBS의 배아를 얼음 위에 놓습니다.
- 가위를 사용하여 배아의 목을 베고 미세 해부 가위를 사용하여 아래턱을 머리의 나머지 부분과 분리합니다(그림 2A). 삼차신경절(trigeminal ganglia)을 손상시키지 않고 아래턱을 정확하게 제거한다. 후자는 아래턱에 가까운 곳에 국한되어 있기 때문에 우발적인 손상이 가능합니다. 아래턱과 머리의 나머지 부분을 얼음 위의 차가운 PBS에 보존합니다.
- 삼차신경절(trigeminal ganglia, TG)을 해부하려면, 머리를 가져다가 이전에 차가운 PBS로 채워져 있던 해부 유리 페트리 접시에 올려놓는다. 집게를 사용하여 피부와 두개골을 제거합니다. 그런 다음 텔렌스팔론과 소뇌 아래에 집게를 놓고 들어 올려 텔렌스팔론과 소뇌를 제거합니다. 텔렌스팔론과 소뇌가 함께 뒤집히면서 두개골의 바닥이 드러납니다.
- 삼차신경절(trigeminal ganglia)을 국소화한다(그림 2B). 집게를 사용하여 삼차 신경에서 TG를 분리합니다. 해부 바늘을 칼로 사용하여 삼차 돌기의 잔해를 제거하십시오. 해부된 TG를 차가운 PBS로 채워진 페트리 접시에 넣고 얼음 위에 보관합니다.
- 배아 치아를 해부하려면 이전에 두개골에서 분리된 아래턱을 차가운 PBS로 채워진 해부 유리 페트리 접시에 놓습니다. 해부 바늘을 칼처럼 사용하여 혀와 턱을 둘러싼 피부를 제거합니다. 턱의 정중선을 따라 잘라 왼쪽과 오른쪽 반턱을 분리합니다. 치아 세균은 그림 2C와 같이 쉽게 볼 수 있습니다. 박리 바늘을 사용하여 치아 세균을 분리하고 과도한 치아가 아닌 조직을 제거합니다. 절개된 치아 세균을 차가운 PBS로 채워진 페트리 접시에 넣고 얼음 위에 보관합니다.
3. 미세유체 공동 배양
- 해부 후 미세유체 장치에서 라미닌을 제거합니다. 챔버에 200μl의 각 매체를 채웁니다.
- 집게를 사용하여 절개된 TG와 치아 세균을 펀칭으로 생성된 구멍으로 부드럽게 옮깁니다(그림 2D). 치아 세균이 뜨지 않고 커버 슬립에 닿을 때까지 가라앉는지 확인하십시오.
- 인큐베이터에서 샘플을 37 ° C, 5 % CO2에서 배양하십시오.
- 48시간마다 배양 매체를 교체하십시오. 챔버를 완전히 비우지 말고 배양실에 직접 피펫팅하지 마십시오.
챔버를 완전히 비우면 챔버 내부에 기포가 형성됩니다. 챔버에 직접 피펫팅하면 축삭 손상이 발생할 수 있습니다. 이러한 문제를 방지하려면 피펫이 웰의 바깥쪽을 향하도록 가리키는 매체를 제거하십시오. 유사하게, 챔버 맞은편에 위치한 우물 쪽에 있는 신선한 매체를 피펫팅합니다.
- 공동 배양은 배양 기간 동안 타임 랩스 현미경으로 쉽게 이미지화할 수 있으며 10일 이상 유지할 수 있습니다.
- 배양 기간이 끝나면 챔버당 하나의 웰에 PBS 150μl를 피펫팅하고 PBS가 챔버를 통해 흐르도록 3회
챔버를 세척합니다.
- PBS를 제거하고 챔버 당 하나의 우물에서 150 μl의 파라 포름 알데히드 4 % (PBS)를 피펫으로 팅하여 샘플을 고정하십시오. 15 분 동안 RT에서 배양하십시오. 3.6에 설명 된 바와 같이 PBS로 챔버를 두 번 세척하십시오.
- 추가 분석을 진행합니다.
