$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
참고: 그림 1A, B는 주 채널 또는 구획, 웰 및 마이크로 그루브의 위치를 포함하여 사전 조립된 순환 올레핀 공중합체(COC) 칩의 개략도를 보여줍니다. 구획화된 칩은 식용 색소 염료의 분리에 의해 입증된 바와 같이 구획 내에서 뚜렷한 유체 미세환경을 설정할 수 있습니다(그림 1C).
1. hSC 뉴런을 위한 다중 구획 칩 코팅
참고: 그림 2A는 코팅 절차의 개요를 보여줍니다.
- 세포 배양 등급의 증류수에 폴리-L-오르니틴을 용해시켜 20μg/mL 작업 용액의 칩당 600μL의 용액을 만듭니다.
- 웰에서 칩을 준비한 후 남은 인산염 완충 식염수(PBS)를 흡인합니다. 흡입할 때 피펫 팁이 채널 개구부에서 멀리 떨어져 있는지 확인하십시오.
메모: 미세유체 채널은 이 절차 전체에 걸쳐 채워진 상태로 유지되어야 합니다. 채널/구획에서 액체를 흡입하지 말고 웰에서만 흡입하십시오.
- 150μL의 폴리-L-오르니틴 작업 용액을 오른쪽 상단 웰에 로드합니다. 90초 동안 또는 액체가 오른쪽 하단 웰을 채우기 시작할 때까지 기다립니다. 오른쪽 하단 웰에 150μL의 매체를 추가하고 액체가 마이크로 홈을 통과할 때까지 5분 동안 기다립니다.
- 150μL의 배지를 왼쪽 상단 웰에 추가합니다. 90초 동안 기다린 다음 왼쪽 하단 웰에 150μL를 추가합니다. 칩 홀더를 파라필름으로 감싸고 4°C에서 하룻밤 동안 놓습니다.
메모: 또는 칩과 홀더를 37°C에서 1시간 동안 놓습니다.
- 웰에서 매체를 흡입하여 피펫 팁이 채널 개구부에서 멀리 떨어지도록 합니다. 150μL의 멸균수를 오른쪽 상단 웰에 추가합니다. 90초 동안 기다린 다음 오른쪽 하단 웰에 150μL를 추가합니다. 액체가 마이크로 홈을 통과할 때까지 5분 동안 기다립니다.
- 왼쪽 상단 웰에 150μL의 멸균수를 추가하고 90초 동안 기다린 다음 왼쪽 하단 웰에 150μL를 더 추가합니다.
- 1.5-1.6단계를 반복합니다.
- 라미닌을 2°C에서 8°C까지 천천히 해동하고 10μg/mL 작업 용액을 준비합니다.
- 150μL의 라미닌 작업 용액을 오른쪽 상단 웰에 로드합니다. 90초 동안 또는 액체가 오른쪽 하단 웰을 채우기 시작할 때까지 기다립니다. 피펫 150 μL를 오른쪽 하단 웰에 놓습니다. 라미닌이 마이크로 홈을 통과할 때까지 5분 동안 기다립니다.
- 150μL의 라미닌을 왼쪽 상단 웰에 추가합니다. 90초 동안 기다린 다음 왼쪽 하단 웰에 150μL를 추가합니다. 홀더 내에서 칩을 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
- 칩을 PBS(Ca2+ 및 Mg2+ 제외)로 헹굽니다. 150μL의 PBS를 오른쪽 상단 웰에 로드합니다. 90초 동안 또는 액체가 오른쪽 하단 웰을 채우기 시작할 때까지 기다립니다. 150μL의 PBS를 오른쪽 하단 웰에 추가하고 PBS가 마이크로 홈을 통과할 때까지 5분 동안 기다립니다.
- 피펫 150 μL의 PBS를 왼쪽 상단 웰에 넣습니다. 90초 후 150μL 피펫을 왼쪽 하단으로 잘 이동시킵니다.
- 칩에서 PBS를 흡입한 다음 NSC 매체로 칩을 헹굽니다(재료 표 참조). 150μL의 배지를 오른쪽 상단 웰에 로드합니다. 90초 후 또는 액체가 오른쪽 채널을 통해 오른쪽 하단 웰로 들어갈 때 오른쪽 하단 웰에 150μL를 추가합니다. 미디어가 마이크로 홈을 통해 흐를 때까지 5분 동안 기다립니다.
- 왼쪽 상단 웰에 150μL의 배지를 추가하고 왼쪽 하단 웰에 150μL를 추가합니다. 37 ° C 인큐베이터에서 5 % CO2로 칩을 배양하여 NSC를 시드 할 준비가될 때까지 칩을 사전 컨디셔닝합니다.
메모: 필요한 경우 칩을 밤새 사전 컨디셔닝할 수 있습니다.
2. NSC를 다중 구획 칩에 시딩
참고: 이 프로토콜은 인간 배아 줄기 세포로 시작한 이전 출판물과 달리 상업적으로 구매한 NSC를 사용했습니다. 이 프로토콜에서 신경 줄기 세포는 플라스틱 칩에 직접 도금되어 뉴런으로 분화합니다. 세포는 최대 2 계대 동안 NSC(분화 없음)로 증식할 수 있으며 추가 사용을 위해 액체 N2 의 바이알에 저장할 수 있습니다. 이 프로토콜은 통과 1 또는 2 후 액체 N2에 저장된 NSC 바이알을 사용합니다. 그림 2B는 코팅 절차의 개요를 보여줍니다.
- 제조업체의 지침에 따라 NSC를 해동하십시오.
메모: 이 절차는 H9 파생 NSC에 적용됩니다. 다른 세포주는 세포 밀도 최적화가 필요합니다.
- 혈구계를 사용하여 세포 농도를 계산하고 NSC 배지를 사용하여 조정하여 mL당 7 x 106 세포의 농도를 얻습니다.
- 칩의 각 웰에서 매체를 흡입합니다. 기본 채널에서 미디어를 흡인하지 마십시오.
- 파이펫 5 μL의 세포 용액을 오른쪽 상단 웰에, 이어서 5 μL를 오른쪽 하단 웰에 넣습니다(총 70,000개 세포). 셀이 주 채널 개구부 쪽으로 피펫으로 연결되어 있는지 확인합니다. 현미경을 사용하여 세포가 채널에 들어갔는지 확인합니다. 셀이 칩 바닥에 부착될 때까지 5분 동안 기다립니다.
메모: 하나 또는 두 구획 모두를 사용하여 셀을 로드할 수 있습니다.
- 피펫 ~150 μL의 NSC 매체를 우측 상단 웰에 배치한 다음 150 μL를 우측 하단 웰에 주입합니다. 왼쪽에서도 반복합니다. 적절한 가습 용기 내에서 5% CO2, 37 °C에서 배양합니다.
- 48시간 후 웰에서 NSC 배지를 흡입하고 각 상단 웰과 각 하단 웰에 150μL를 추가하여 신경 분화 배지로 교체합니다.
- 적절한 가습 용기 내에서 5% CO2, 37 °C 인큐베이터 내에서 뉴런을 배양합니다.
