출생 후 마우스 소뇌에서 줄기세포의 분리 및 신경 세포로의 분화

초록

출처: Edamakanti, C. R., et al. 출생 후 마우스 소뇌에서 Prominin-1⁺ 줄기 세포 정제. J. Vis. 특급 (2020).

이 동영상은 출생 후 쥐 소뇌에서 줄기세포를 분리하여 신경세포로 분화하는 방법을 보여줍니다. 분리된 세포 현탁액의 줄기세포는 항체로 코팅된 마그네틱 비드를 사용하여 정제되고 배양되어 신경구를 형성합니다. 그런 다음 신경구는 신경 세포를 생성하기 위해 분화 매질에서 유지됩니다.

프로토콜

1. 솔루션 준비

1. 파파인(100 U/ml), 시스테인(0.2 mg/ml) 및 데옥시리보뉴클레아제(DNase, 250 U/ml)가 함유된 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)를 함유한 멸균 페놀 레드로 만든 조직 해리 용액을 준비합니다.
2. DNase 용액을 준비하기 위해 DNase I의 동결 건조 분말 100mg(1병)을 H_{, 2}O 50mL에 희석하고 원액을 잘 혼합하고 여과합니다. 10mL의 스톡 부분 표본을 준비합니다. 스톡 튜브 1개를 0.5mL 일회용 부분 표본으로 나눕니다. 이 일회용 부분 표본은 -80 °C에서 보관하십시오.
3. 마그네틱 컬럼 버퍼 X: 0.5% 소 혈청 알부민(BSA) 및 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액을 준비하여 자기 분리 시약을 준비합니다.
4. 신경구 배지를 준비하려면 페니실린/스트렙토마이신과 L-글루타민을 함유한 신경기저 배지를 사용하고 2% B27, 20ng/mL 인간 재조합 표피 성장 인자(EGF) 및 20ng/mL 인간 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 보충합니다.
5. 분화 배지를 준비하려면 neurobasal 배지를 사용하고 10ng/mL 분화 인자 혈소판 유래 성장 인자(PDGF-AA) 또는 10ng/mL 백혈병 억제 인자(LIF) 및 2% B27을 보충합니다.
6. 초저 부착 12웰(3.5cm²) 및 6웰(9.6cm²) 배양 플레이트를 사용하십시오.

2. 소뇌 해부

1. 새끼 쥐(P3-P7)를 이소플루란으로 마취하고 수술용 가위를 사용하여 목을 베습니다.
2. 분리된 강아지 머리에 70% 에탄올을 뿌립니다.
3. 각 머리를 10cm 크기의 빈 멸균 접시에 옮깁니다. 현미해부 가위를 사용하여 피부를 분리한 다음 정중선을 따라 가위를 시상으로 움직여 두개골을 제거합니다.
4. #7 집게를 사용하여 뇌간에서 꼬리 방향으로 시작하는 두개골 뼈를 벗겨냅니다. 소뇌를 그대로 유지하면서 주걱을 사용하여 조심스럽게 뇌를 들어 올리고, 얼음처럼 차가운 행크스 균형 소금 용액(HBSS) 용액 15mL가 들어 있는 신선한 멸균 10.0cm 접시에 뇌를 옮깁니다.
5. 뇌가 들어있는 접시를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 미세한 #5 겸자를 사용하여 소뇌에서 수막과 큰 혈관을 제거하고 주걱을 사용하여 뇌간에서 소뇌를 분리합니다.
6. 소뇌를 5.0mL의 얼음처럼 차가운 HBSS 용액이 들어 있는 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. HBSS 5.0mL로 3x 헹구고 디캔팅하여 소뇌를 세척합니다.
   메모: 각 소뇌는 추가 처리를 위해 자체 튜브에 삽입해야 합니다.

3. 세포 현탁액 준비

1. 뇌가 들어있는 접시를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 미세한 #5 겸자를 사용하여 소뇌에서 수막과 큰 혈관을 제거하고 주걱을 사용하여 뇌간에서 소뇌를 분리합니다.
2. 소뇌를 5.0mL의 얼음처럼 차가운 HBSS 용액이 들어 있는 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. HBSS 5.0mL로 3x 헹구고 디캔팅하여 소뇌를 세척합니다.
   메모: 각 소뇌는 추가 처리를 위해 자체 튜브에 삽입해야 합니다.
3. 마지막 헹굼 후 37°C로 예열된 파파인 기반 조직 해리 용액 5mL를 추가합니다.수조에서 37°C에서 15분 동안 조직을 배양합니다. 너트 믹서를 사용하거나 손으로 튜브를 3분마다 3x-5x 위아래로 뒤집어 내용물을 천천히 섞습니다.
4. 앞에서 설명한 대로 넓은 직경의 (일반 유리 피펫)과 좁은 직경의 파스퇴르 피펫 (분젠 버너에서 가열하여 불 연마)을 준비하십시오.
5. HBSS 용액 5mL로 조직을 3회 세척하여 손으로 디캔팅하는 동안 조직이 손실되지 않도록 합니다.
6. 마지막 HBSS 세척을 제거하고 250μL의 DNase 용액이 포함된 5mL의 DPBS 용액을 조직에 추가합니다. 직경이 넓은 파스퇴르 피펫을 사용하여 10x–15x를 분쇄하여 조직을 해리합니다. 거품이 형성되지 않도록 이 단계를 부드럽게 수행하십시오.
7. 그런 다음 수조에서 37°C에서 10분 더 슬러리를 배양하고 튜브를 뒤집고 곧게 펴서 혼합합니다.
8. 감소된 직경의 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직 슬러리를 10배 더 분쇄합니다. 큰 조직 조각이 남아 있으면 피펫 끝으로 조직 조각을 튜브 바닥에 부드럽게 누르고 세포가 미세한 현탁액에 도달할 때까지 피펫팅을 계속합니다.
9. 37°C에서 10분 더 조직을 배양하고 이전 혼합 단계를 반복합니다.

4. 줄기세포의 면역표지

1. 원심분리기 튜브를 얼음 위에 놓고 얼음처럼 차가운 용액을 사용하여 다음 단계를 수행합니다. 해리된 세포를 40μm 세포 여과기를 통해 50mL 원심분리 튜브로 변형시킵니다. 이 추가 용액에서 세포가 메쉬를 통과하도록 하기 위해 10.0mL의 HBSS 용액으로 필터 위에 얹습니다.
2. 여과된 세포를 새로운 15mL 원심분리 튜브로 옮기고 4°C에서 10분 동안 300 x g에서 세포 현탁액을 원심분리합니다.흡입하고 진공 흡입기를 사용하여 조심스럽게 상층액을 완전히 폐기합니다.
3. 펠릿을 160μL의 마그네틱 컬럼 버퍼에 재현탁시킵니다. 마그네틱 라벨링 전에 단일 세포 현탁액을 얻으려면 30μm 나일론 메쉬를 통해 세포를 통과시켜 컬럼을 막을 수 있는 세포 덩어리를 제거합니다.
4. 각 15mL 튜브에 40μL의 anti-prominin-1 마이크로비드를 첨가하고 혼합한 후 항체가 prominin-1 발현 세포에 결합할 수 있도록 냉장고에서 15분 동안 배양합니다.
5. 1.0–2.0mL의 컬럼 버퍼 X를 추가하고 300 x g에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 세척합니다. 상층액을 완전히 흡인합니다.
6. 펠릿을 1.0mL의 컬럼 버퍼 X.
   에 재현탁합니다. 메모: 1.0mL의 컬럼 버퍼 X로 펠렛을 재현탁한 후 작은 덩어리가 보이면 파스퇴르 파이펫의 팁을 사용하여 조심스럽게 제거해야 하며, 그렇지 않으면 이러한 덩어리가 세포 분류 중에 자기 컬럼을 차단할 수 있습니다.

5. 마그네틱 컬럼 준비, 세포 분류 및 도금

참고: 지연이 신경구 형태에 영향을 미칠 수 있으므로 서로 다른 유전자형 상태(질병 대 대조군)로부터의 자기 분리를 동시에 수행해야 합니다.

1. 자기장에 노출된 자기 스탠드에 자기 기둥을 놓아 준비합니다. 폐기할 원심분리 튜브에 떨어지는 완충액을 적용하여 500μL의 완충액 X로 컬럼을 한 번 헹굽니다.
   메모: 각 실험에 대해 새로운 자기 컬럼 버퍼 X를 준비합니다. 그렇지 않으면 줄기세포 수율이 낮아집니다.
2. 라벨링된 세포 현탁액을 컬럼에 적용합니다. 주로 소뇌 신경세포/신경교세포로 구성된 라벨링되지 않은 세포를 포함하는 플로우스루를 새로운 15mL 튜브로 수집합니다(그림 1A).
3. 500μL의 버퍼(X)로 컬럼을 3회 세척합니다(각 세척에는 약 2–4분 소요).
   메모: 소뇌 과립 뉴런이 풍부한 소뇌 뉴런/신경교 혼합 배양은 이 정제 단계의 유용한 부산물로 작용할 수 있습니다.
4. 자기장에서 컬럼을 제거하고 1.5mL 튜브에 넣습니다. 컬럼에 1.0mL의 배양 배지(신경구 배지)를 추가하고 플런저를 컬럼에 밀어 넣어 프로미닌-1 비드로 태그된 세포를 새로운 1.5mL 매 튜브로 플러시합니다.
5. prominin-1 표지된 세포의 순도를 높이려면 5.1–5.4단계에 따라 용출된 세포를 두 번째 열에 전달합니다.
6. 혈구계로 세포를 세십시오. 일반적인 수율은 소뇌당 10⁷ 세포입니다. 세포를 초저 부착 플레이트(다운스트림 실험에 필요한 밀도에 따라 6 또는 12-well)에 플레이트
링합니다.

6. 신경구의 통과와 분화

1. 프로미닌-1 표지 줄기세포를 신경구 배지(5,000 cells/well)의 초저 부착 12웰 플레이트에 플레이트
화합니다.
2. 7-10일 후, 세포는 분열하여 공 모양의 떠다니는 신경구(1차 신경구)를 생성합니다.
   메모: 이 실험에서는 숫자가 확장되는 2차 신경구가 추가 사용을 위해 생성됩니다. 1차 신경구 집단은 줄기세포 특성이 없고 신경구와 함께 뭉칠 수 있는 오염 세포를 포함할 수 있기 때문에 이러한 실험에 사용되지 않습니다.
3. 계대 형성을 위해 1.0 mL 피펫 팁을 사용하여 배양 배지와 함께 1차 신경구를 15 mL 멸균 원심분리 튜브로 옮깁니다. 300 x g에서 5분 동안 원심분리하여 신경구를 펠렛화하고 상층액을 버립니다.
4. 파파인 또는 0.05% 트립신 용액을 함유한 5mL의 조직 해리 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 37 °C에서 10 분 동안 배양합니다.
5. 세포 현탁액을 300 x g에서 5분 동안 원심분리하고 5mL의 신경구 배지에 세포를 재현탁시키고 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 천천히 위아래로 10회 피펫팅하여 세포를 기계적으로 해리합니다.
6. 앞에서 설명한 대로 신경구 매체에 세포를 (다시) 플레이트합니다. 배양에서 7-10일 후, 플레이트는 2차 신경구로 풍부해져야 합니다.
   메모: 이러한 배양물은 우수한 효율로 최대 8배까지 통과할 수 있으며, 그 이후에는 신경구 크기가 더 작아지는 경향이 있어 증식 감소를 암시합니다.
7. 혈구계에서 세포를 세고 poly-D-lysine 코팅 플레이트(6 또는 12 well)에서 향후 실험을 위한 최적의 수를 플레이트에 표시합니다.
8. 줄기세포를 분화하려면 펠릿에 분화 배지를 추가하는 것을 제외하고 앞서 설명한 대로 원심분리를 통해 두 번째 통과에서 여덟 번째 통과에서 신경구를 수집합니다.
   메모: in vitro 7일 후, 줄기세포는 뉴런, 성상세포, 희소돌기아교세포로 분화하며, 이는 뉴런 마커 β-III tubulin, 성상세포 마커 Glial fibrillary acidic protein (GFAP) 및 희소돌기아교세포 마커 O4로 염색하여 입증되었습니다.

결과

그림 1: 출생 후 소뇌에서 프로미닌-1 줄기세포 분리. (A) 소뇌 줄기세포는 면역자기 프로미닌-1 비드를 사용하여 분리했습니다. 상단 패널: 정제된 줄기세포(컬럼 결합)는 광범위한 증식 및 자가 재생 특성을 가진 신경구를 형성했습니다. 기둥에 결합되지 않은 세포(플로우스루)는 신경구를 형성할 수 없었습니다. 대신, 그들은 소뇌 신경세포/신경교세포(β-III tubulin/GFAP)가 되었습니다. 하단 패널: 줄기세포 특이적 마커를 발현하는 프로미닌-1⁺ 세포로 형성된 신경구: Nestin, prominin-1 및 GFAP. (B) 줄기세포 마커 prominin-1 및 nestin에 대해 음성으로 염색된 플로우스루의 세포와 β-III 튜불...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.05% 트립신	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	25300054	0.05%
2% B27	기코; 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	17504001
2mM EDTA 솔루션	코 닝	46-034-CI
안티 프로미닌-1 마이크로비즈	밀테니 비오테	Tel.: 130-092-333
소 혈청 알부민	시그마	A9418
컬럼 MultiStand	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-042-303
배양 플레이트 울트라 - 낮은 부착성	코 닝	3473
시스테인	시그마	C7880
DNase	시그마	D4513-1VL	250 U/ml
Dulbecco의 인산염 완충액 식염수	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	14040141
행크의 균형 잡힌 소금 용액 - HBSS	지브코	제14025-092
인간 재조합 염기성 섬유아세포 성장인자(Basic Fibroblast Growth Factor	프로메가	G507A	20 ng / ml
인간 재조합 표피 성장 인자	프로메가	G502A	20 ng / ml
백혈병 억제 인자	시그마	L5158
L-글루타민	지브코	25030081
현미경 검사 법	Lieca TCS SP5 컨포칼 현미경
MiniMACS 분리기	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-042-102
마우스 안티 Prominin-1	Affymetrix eBioscience (영문	14-1331	1의 100
네스틴	아브캠	AB27952	1의 200
Neurobasal 배지	써모 피셔	25030081
오4	밀로포어	MAB345
파파인	워 딩 턴	LS003126	(100U/ml)
혈소판 - 파생 성장 인자	시그마	H8291	10 ng / ml
폴리-D-라이신	시그마	P6407
토끼 항 튜불린, B-III	시그마	T2200	1의 500
Rabit 안티 GFAP	다코	Z0334	1의 500
분리 컬럼 - MS 컬럼	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-042-201
멸균 세포 여과기	피셔 사이언티픽	22363547	40음

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