망막 신경절 뉴런과 후각 외피 신경교세포의 공동 배양

초록

출처: Portela-Lomba, M., et al. 성인 축삭 재생의 체외 모델로서 후각 외피 신경교와 축삭 절개화 된 쥐 망막 신경절 뉴런의 공동 배양. J. Vis. 특급 (2020년)

이 비디오는 쥐의 망막에서 망막 신경절 뉴런(RGN)을 분리하고 후각 외피 신경교세포(OEG) 세포와 공동 배양하는 절차를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 신경 손상 후 OEG의 신경 재생 잠재력을 연구할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 분석을 위한 ihOEG(Ts12 및 Ts14) 준비

참고: 이 단계는 RGN 해부 및 공동 배양 24시간 전에 수행해야 합니다.

1. 12mm Ø 커버슬립을 10μg/mL 폴리-L-라이신(PLL)으로 1시간 동안 처리
   메모: 커버슬립은 PLL 용액에 밤새 방치할 수 있습니다.
2. 1x 인산염 완충액 식염수(PBS)로 커버슬립을 세 번 세척합니다.
3. p60 세포 배양 접시에서 Ts12 및 Ts14 ihOEG 세포를 분리합니다.
   1. 15mL 원뿔형 튜브에 DMEM/F12(기저 배지)-FBS(소 태아 혈청) 배양 배지 4mL를 추가합니다. 깨끗한 수조에서 37 °C로 데우십시오.
   2. 플레이트에서 배지를 제거하고 1x PBS(인산염 완충 식염수)-EDTA(에틸렌 디아민 테트라아세트산) 1mL로 세포를 한 번 세척합니다.
   3. OEG 세포에 트립신-EDTA 1mL를 추가하고 37°C, 5% CO₂에서 3-5분 동안 배양합니다.
   4. p1000 피펫으로 세포를 수집하고 2.1단계에서 준비한 배지로 옮깁니다.
   5. 200 x g에서 5분간 원심분리기
   .
   6. 상층액을 열망하십시오.
   7. ME10 배지 1mL를 추가하고 펠릿을 재현탁합니다.
   8. 혈구계에서 세포 수를 세십시오.
4. 80,000 Ts14 세포 또는 100,000 Ts12 세포/웰을 500 μL의 ME10 배지에서 24-well 플레이트의 커버슬립에 시딩합니다.
5. 37 ° C에서 5 % CO₂ 에서 24 시간 동안 세포를 배양합니다.

2. 망막 조직 해부

참고: 2개월 된 수컷 Wistar 쥐가 RGN 소스로 사용됩니다. 24웰 세포 접시의 20웰에 대한 2개의 망막(쥐 1마리). 사용하기 전에 수술 재료를 오토클레이브하십시오. 파파인 해리 키트는 상업적으로 구매됩니다(재료 표). 재구성을 위해 공급자의 지침을 따릅니다. D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid (APV)를 5 mM stock에서 재구성하고 부분 표본을 준비합니다.

1. 분석 당일에는 다음 배지를 준비합니다.
   1. 차가운 EBSS(Earle's balanced salt solution) 5mL(파파인 해리 키트의 바이알 1)와 함께 p60 세포 배양 접시를 준비합니다.
   2. 파파인 해리 키트의 재구성된 바이알 2(파파인)와 50μL의 APV가 포함된 p60 세포 배양 접시를 준비합니다. 그런 다음 250μL의 재구성된 바이알 3(DNase와 5μL의 APV)을 추가합니다.
   3. 멸균 튜브에서 2.7mL의 바이알 1과 300μL의 바이알 4(알부민-오보뮤코이드 프로테아제 억제제)를 혼합합니다. 150μL의 바이알 3(DNase)과 30μL의 APV를 추가합니다.
   4. Neurobasal-B27 배지(NB-B27) 20mL를 준비합니다.
2. CO₂로 쥐를 질식시켜 희생시킵니다.
3. 단두대로 참수하여 머리를 제거하십시오. 100mm 페트리 접시에 넣고 층류 후드에 넣기 전에 머리에 에탄올 70%를 뿌립니다.
4. 쥐의 수염을 가위로 잘라 눈 조작을 방해하지 않도록 합니다.
5. 겸자로 시신경을 잡고 메스로 눈을 절개할 수 있을 만큼 안구를 빼냅니다.
6. 수정체와 유리체액을 제거하고 눈의 나머지 층(색소 상피층 포함)은 내부에 남아 있는 동안 망막(주황색 조직)을 빼냅니다.
7. 2.1.1단계에서 준비한 p60 세포 배양 접시에 망막을 놓습니다.
8. 2.1.2단계에서 준비한 p60 세포 배양 접시에 망막을 옮기고 메스로 약 1mm 크기의 작은 조각< 자릅니다.
9. 15mL 플라스틱 튜브에 옮깁니다.
10. 37°C의 가습 인큐베이터에서 5% CO₂ 이하로 30분 동안 조직을 10분마다 교반하면서 배양합니다.
11. 유리 파스퇴르 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 세포 덩어리를 해리합니다.
12. 200 x g에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.
13. 상등액을 버리십시오. 파파인을 비활성화하려면 2.1.3단계에서 준비한 용액(2개의 눈의 경우 1.5mL)에 세포 펠렛을 재현탁합니다.
14. 이 세포 현탁액을 5mL의 재구성된 바이알 4에 조심스럽게 피펫으로 주입합니다.
15. 200 x g에서 5분 동안 원심분리기
16. 원심분리하는 동안 OEG 24 웰 셀 플레이트(이전에 1단계에서 준비)에서 ME-10 배지를 완전히 제거하고 웰당 500μL의 NB-B27 배지로 교체합니다.
17. 상등액을 버리고 NB-B27 배지 2mL에 세포를 재현탁합니다.
18. m24 플레이트의 웰당 100μL의 망막 세포 현탁액을 PLL 처리 또는 OEG 단층 커버슬립에 플레이트합니다.
19. NB-B27 배지에서 96시간 동안 5% CO₂로 37°C에서 배양을 유지합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
B-27 보충제	지브코	17504044
D, L-2- 아미노 -5- 포스 포노발레릭 산	시그마	283967	NMDA 수용체 억제제
DMEM-F12	지브코	11320033	세포 배양 배지
FBS(증권 시세	지브코	11573397	소 태아 세럼
FBS-하이클론	피셔 사이언티픽	16291082	소 태아 세럼
L-글루타민	론자	BE17-605F
Neurobasal 배지	지브코	21103049	신경 세포 배양 배지
파파인 해리 시스템	워딩턴 생화학 공사	LK003150	신경 세포 분리에 사용
PBS (PBS)	집에서 만든
PBS-에디타	론자	H3BE02-017F
페니실린/스트렙토마이신/암포테리신 B	론자	17-745E	정균 및 살균
뇌하수체 추출물	지브코	13028014	소 뇌하수체 추출물
폴리-L-라이신(PLL)	시그마	A-003-M

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