쥐의 머리 근육 조직에서 위성 세포를 분리하는 기술

초록

출처: Carvajal Monroy, P. L., et al. 쥐 머리 분지 근육에서 위성 세포의 격리 및 특성화. J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오는 조직 해부, 효소 분해 및 후속 기계 및 원심 정제를 통해 쥐 머리 분지 근육 조직에서 위성 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 그런 다음 세포는 세포외 기질로 코팅된 웰에 파종되어 근아세포로 분화되고 최종적으로 근관과 성숙한 근섬유로 분화됩니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 세포외 기질 젤 반점

1. 격리 하루 전에 다음 단계를 수행합니다.
   1. 적어도 1.5 hr. Dulbecco의 변경한 독수리의 매체에 있는 1:10를 묽게 하십시오; 4,500 mg/L 포도당, 4 mM L 글루타민 및 110 mg/ml 나트륨 피루브산 (DMEM)로, 세포외 기질 젤 (100 μl)의 분취액을 녹입니다. 세포외 매트릭스 겔을 항상 4°C로 유지하십시오.
      알림: 급격한 온도 변화로 인해 코팅이 고르지 않고 결정이 형성됩니다.
   2. 희석된 세포외 매트릭스 젤 용액을 얼음 위에 15분 동안 보관합니다.
   3. 20μl 마이크로피펫을 10분 동안 예열합니다.
   4. 8웰 챔버 슬라이드를 100mm 페트리 접시에 넣고 접시를 차가운 표면(예: 냉동 팩)에 10분 동안 옮깁니다.
   5. 미리 식힌 마이크로피펫을 사용하여 각 웰에 10μl의 세포외 기질 젤을 한 방울 떨어뜨립니다. 페트리 접시를 차가운 표면에 최소 7분 동안 더 보관하십시오(그림 1A).
   6. 남아 있는 세포외 기질 겔(그림 1B)을 완전히 제거하고 웰을 37°C에서 밤새 건조시킵니다.

2. 머리 근육 해부 (교근, 이가근 및 levator Veli Palatini)

1. 해부 전에 50%의 페니실린-스트렙토마이신(P/S)이 보충된 인산염 완충 식염수(PBS) 2ml를 준비합니다. 얼음 위에 보관하십시오.
2. CO₂/O₂에 감염된 젊은 성인 쥐 한 마리(9주)를 안락사시킨 후 머리의 목을 베고 머리에서 피부를 제거합니다. 50ml 튜브에 2% P/S를 보충한 얼음처럼 차가운 PBS로 머리를 옮깁니다.
3. 마세터 근육(Masseter muscle) (제1분지궁에서 유래)
   1. 실리콘 패드에 머리를 한쪽이 위로 향하게 하여 놓고 피하 주사 바늘로 고정합니다(그림 2A).
   2. 이하선과 안면 신경을 확인합니다(그림 2A). 분비샘을 덮고 있는 깊은 근막을 노출시킵니다. 근막을 자르고 해부 가위를 사용하여 샘을 제거합니다. 외이도를 확인합니다. 스타일로마스토이드(stylomastoid foramen)에서 안면 신경을 추적하여 메스 날 15번으로 측두, 접합 및 협측 가지를 조심스럽게 제거합니다.
   3. 근막을 제거하여 교근의 표재성 머리를 제거합니다. 교근의 표재성 머리와 깊은 머리를 모두 식별합니다. 두꺼운 건막(tendinous aponeurosis)이 상악골의 접합 돌기(zygomatic process)에 삽입될 때까지 표재성 머리를 추적한다.
   4. 접합 과정에서 직선 집게로 힘줄을 원점으로부터 분리하십시오. 메스 날 15번 또는 해부 가위로 자르고 조심스럽게 들어 올립니다(그림 2B).
   5. 메스 날 번호 15 (그림 2C)로 하악골의 골 측면 표면의 각도와 아래쪽 절반에 삽입 될 때까지 교근의 표재성 머리를 해부합니다. 이제 근육을 완전히 제거하십시오.
4. 이위근(digastric muscle)의 후복부(2nd branchial arch에서 유래)
   1. 머리를 실리콘 패드에 누운 자세로 놓고 피하 주사 바늘로 고정합니다(그림 3A).
   2. 설하선과 턱밑 땀샘 위에 있는 피하 지방을 제거합니다. 그런 다음 해부 가위를 사용하여 표재성 근막과 땀샘을 제거합니다. 이위근(전복부 및 후배)을 노출시킵니다.
   3. 곧은 집게로 뒤쪽 배의 앞쪽 힘줄을 잡고 절단한 다음 원점이 고막 수포에 있을 때까지 조심스럽게 절개합니다(그림 3B). 반대쪽 쪽에서도 동일한 작업을 수행합니다.
5. Levator veli palatini muscle (제 4 분지 아치에서 유래)
   1. 이위근의 후복부를 절개한 후 첨탑근을 국소화하고 측면으로 당겨 조심스럽게 제거합니다(그림 4A).
   2. 고막(tympanic bulla)에 삽입하는 levator veli palatini의 힘줄을 국소화합니다(그림 4A). 조심스럽게 해부하고 양쪽을 자릅니다.
   3. 기관과 그 뒤를 잇는 식도를 찾으십시오. 식도를 들어 올리고 인두와 후두를 노출시킵니다.
   4. 상인두 수축근(superior pharyngeal constrictor muscle)의 부위를 국소화하고 절개합니다. levator veli palatini를 식별하고 양쪽에서 자릅니다(그림 4B).
      메모: 절제 직후 실체 현미경으로 각 근육의 힘줄과 결합 조직을 조심스럽게 제거합니다. 모든 검체를 70% 에탄올에 빠르게 담그고 15ml 튜브에 2% P/S가 보충된 얼음처럼 차가운 PBS로 옮깁니다.

3. 위성 셀(SC)의 격리

1. 세 가지 근육 그룹에서 SC 분리를 위해 다음 준비 단계를 수행합니다.
   1. DMEM에서 0.1% 프로나제 7.5ml를 준비합니다. 0.22μm 필터를 통해 용액을 여과합니다. 분리하기 전에 용액을 37°C의 수조에서 10분 동안 예열합니다.
   2. 10% 호스 세럼(HS)과 1% P/S가 보충된 DMEM 35ml를 준비합니다. 또한 수조에서 37°C로 예열합니다.
   3. 20% 소 태아 혈청(FBS), 10% HS, 1% P/S 및 1% 닭 배아 추출물(CEE)이 보충된 DMEM으로 구성된 15ml 배양 배지를 준비합니다. 수조에서 37 °C로 예열합니다.
   4. 6개의 플라스틱 피펫(10ml)에 HS를 사전 코팅하고 사용하기 전에 최소 10분 동안 건조시킵니다.
2. 배양 후드에서 각 근육을 6웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 해부 가위를 사용하여 근육을 약 2mm의 작은 조각으로 자릅니다. 티슈를 너무 많이 다지지 않도록 주의하세요.
3. 각 웰에 0.1% 프로나제 용액 2.5ml를 조심스럽게 넣고 37°C에서 60분 동안 배양합니다. 20분, 40분, 60분 후에 플레이트를 부드럽게 흔듭니다.
   메모: 정확한 부화 기간은 동물의 나이와 변형률과 같은 요인에 따라 다릅니다.
4. 현미경으로 모니터링합니다. 근육 조각을 확인하고 섬유 다발이 느슨해진 것처럼 보이면 효소 분해를 중단합니다(그림 5).
5. 10% HS 및 1% P/S가 보충된 DMEM 2.5ml를 추가합니다. 15ml 튜브에 옮기고 400 x g에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 디캔테이션으로 상층액을 폐기합니다.
6. 10% HS와 1% P/S가 보충된 5ml DMEM을 첨가하고 10ml 플라스틱 피펫(trituration)으로 용액을 위아래로 최소 20회 피펫팅하여 조직을 균질화합니다.
7. 튜브를 200 x g에서 4분 동안 원심분리하고 상층액을 모아 15ml 튜브에 옮깁니다.
8. 10% HS와 1% P/S가 보충된 5ml DMEM을 10ml 플라스틱 피펫으로 다시 조직 조각이 쉽게 통과할 때까지 피펫을 추가합니다.
9. 200 x g에서 튜브를 4분 동안 원심분리하고 15ml 튜브에 상층액을 수집합니다.
10. 50ml 튜브에 세포 여과기(40μm)를 넣고 해리된 세포가 포함된 상등액을 필터로 옮깁니다. 최대 세포 회복을 위해 1ml DMEM으로 세척하십시오.
11. 1,000 x g에서 튜브를 10분 동안 원심분리하고 피펫으로 상층액을 버립니다.
12. 펠릿을 300μl 배양 배지에 재현탁시키고 혈구계에서 세포를 계수합니다.

4. 세포외 기질 젤 반점에 대한 위성 세포의 분화

1. 세포 현탁액을 희석하여 10 μl의 배양 배지에서 1.5 x 10³ 세포를 얻는다.
2. 챔버 슬라이드의 덮개를 테이프로 고정하고 물체 유리의 바닥면에 검은색 마커로 반점을 표시합니다.
3. 마이크로피펫을 사용하여 10μl 세포 현탁액을 세포외 기질 겔 스폿에 떨어뜨립니다. 현미경으로 세포 현탁액의 방울이 그 자리에 올바르게 놓였는지 확인하십시오. 37 °C에서 6 시간 동안 배양하십시오.
4. 400μl의 배양 배지(20% FBS, 10% HS, 1% P/S 및 1% CEE가 보충된 DMEM)를 조심스럽게 추가하고 37°C에서 3일 동안 배양합니다.
   메모: 이 시점에서, 갓 격리된 SC는 엄청난 외상(효소 소화 및 가혹한 분쇄)을 겪게 되며 회복이 필요합니다. 처음 3일 동안은 세포를 건드리지 마십시오. 다음으로, 배양 배지는 실험 유형에 따라 변경될 수 있습니다.
   세포외 매트릭스 겔 스팟은 분화 분석을 위해 높은 세포 밀도(1.5-2.5 x 10³/20 μl)로 파종할 수 있습니다. 배양 배지(20% FBS, 10% HS, 1% P/S 및 1% 닭 배아 추출물이 보충된 DMEM)는 3일에 한 번씩 교체할 수 있습니다.

결과

그림 1: 챔버 슬라이드의 세포외 기질 겔 반점. (A) 쉽게 조작할 수 있도록 8웰 챔버 슬라이드를 100mm 페트리 접시에 넣습니다. 각 챔버에 10μl 세포외 기질 젤을 피펫하고 차가운 표면(7분)에 놓습니다. (B) 과량의 세포외 기질 겔이 제거된 후의 챔버 슬라이드.

그림 2: 교근 절제. (A) 측면에서 본 동물의 머리. 귀(E), 이하선(P) 및 안면 신경(V...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
피하 주사 바늘 25 g 0.5 x 25 미터	BD 마이크로랜스	300400
가위 해부	브라운	기원전154R
마이크로 집게 스트레이트	브라운	BD330R
수술용 메스 칼날 No. 15	스완-모튼	0205
알코올 70%	덴텍	2,010,005
Permanox 슬라이드, 8 챔버	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	177445
6웰 세포 배양 플레이트	그라이너 바이오 원	657160
세포 배양 접시 (100 x 20 mm)	그라이너 바이오 원	664160
15ml 멸균 원추형 원심분리기 튜브	BD 바이오사이언스	352097
50ml 멸균 원추형 원심분리기 튜브	BD 바이오사이언스	352098
셀 스트레이너(40μm)	지브코	제431750
10 ml 혈청 피펫	그라이너 바이오 원	607180
20 μl FT20	그라이너 바이오 원	774288
마트리겔, 페놀-레드 프리	BD 바이오사이언스	356237	10 밀리리터
프로나제	칼바이오켐	53702	10 구
인산염 완충 식염수	지브코	14190-144	500 밀리리터
Dulbecco's Modified Eagle Medium, 고혈당, GlutaMAX 보충제, 피루브산	지브코	10569-010	500 밀리리터
소 태아 세럼	피셔 사이언티픽	3600511	500 밀리리터
호스 세럼	지브코	26050088	500 밀리리터
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/ml)	지브코	15140-122	100 밀리리터
닭 배아 추출물	MP 바이오메디컬	2850145	20 밀리리터

년 ) 호 년 년 년