마우스 배아 암종 세포를 이용한 레티노산 유도 신경 발생

초록

출처: Leszczyński, P., et al., P19 배아 암종 세포를 이용한 신경 발생 J. Vis. Exp. (2019)

이 비디오는 P19 마우스 배아 암종 세포에서 레티노산 유도 신경 발생에 대한 간단한 기술을 보여줍니다. 레티노산(Retinoic acid)은 전사 인자(transcription factor)를 활성화하고 신경 세포 분화를 위한 유전자 발현을 유발합니다.

프로토콜

1. 집계 생성

1. 10mL의 분화 배지에 5μL의 RA(레티노산)(99.8% 에탄올에 용해된 1mM 스톡, -20°C에서 보관)를 추가하고 잘 혼합합니다(최종 농도 0.5μM RA).
   메모: RA는 빛에 민감합니다. 낮은 농도의 에탄올은 세포 분화에 영향을 미치지 않습니다.
2. 10mL의 분화 배지(RA 포함)를 100mm 비처리 배양 접시(현탁 배양 전용)에 추가합니다.
3. 10mm 접시에 1 x^{10 6} 셀을 100 (접시 표면적 56.5cm2)에 파종합니다.
4. 세포가 있는 플라스크를 37°C, 5% CO₂에서 2일 동안 인큐베이터에 넣어 응집체 형성을 촉진합니다.
5. 2일 후 분화 매체를 교환합니다. 10mL 피펫을 사용하여 응집체가 포함된 배지를 흡입하고 RT에서 15mL 튜브로 이동합니다.
6. 응집체가 RT에서 1.5분 동안 중력에 의해 침전되도록 합니다.
7. 상등액을 버리십시오.
8. 10mL 혈청학 피펫을 사용하여 0.5μM RA의 새로운 10mL 분화 배지를 추가합니다.
   주의: 세포 응집체를 위아래로 피펫팅하지 마십시오.
9. 응집체를 새로운 100mm 비처리 배양 접시(현탁 배양 전용)에 파종합니다.
10. 플레이트를 인큐베이터(37°C 및 5% CO₂)에 2일 동안 놓습니다.

2. 집계 해리

1. 10mL 피펫을 사용하여 세포 응집체를 흡입합니다.
2. 응집체를 15mL 튜브로 옮깁니다. 세포 응집체가 1.5분 동안 중력에 의해 침전되도록 합니다.
3. 상층액을 제거합니다.
4. DMEM만 사용하여 응집체를 세척합니다(혈청 및 항생제 무함유).
5. 세포 응집체가 RT에서 1.5분 동안 중력 침전에 의해 침전되도록 합니다.
6. 상층액을 흡입하고 트립신-EDTA 2mL(0.25%)를 첨가합니다.
7. 세포 응집체를 수조(37°C)에 10분 동안 넣고 손으로 두드려 2분마다 응집체를 부드럽게 저어줍니다.
8. 4mL의 Maintenance Medium을 추가하여 트립신화 과정을 중지합니다.
9. 1mL 피펫을 사용하여 응집체를 위아래로 20회 피펫팅합니다.
10. 200 x g 및 RT에서 5분 동안 원심분리 셀.
11. 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 5mL의 유지 배지에 재현탁합니다.
12. 셀 카운터로 셀 번호를 확인합니다.

3. 도금 셀

1. 6웰 플레이트에 Maintenance Medium당 3mL를 추가합니다.
2. 6-well 배양 플레이트의 종자 세포를 0.5 x 10⁶/well의 밀도로 만듭니다.
3. 37°C에서 5% CO₂ 농도로 배양합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM 고포도당(4.5g/L) 및 L-글루타민	론자	BE12-604Q
에탄올 99.8%	쳄푸르	화학*613964202
소 태아 세럼(FBS)	유로	E5050-03
페니실린/스트렙토마이신 10K/10K	론자	데17-602E
인산염 완충 식염수(PBS), 칼슘 및 마그네슘 이온 없이 농축된 1배	론자	BE17- 517Q
레티노산	시그마- 알드리치	R2625-50MG	99.8% 에탄올에 용해, -20°C에서 최대 6개월 보관
트립신 0.25% - HBSS의 EDTA, 칼슘 및 마그네슘 이온 없음, 페놀 레드	바이오세라	LM-T1720/500
1 mL 혈청학적 피펫	프로파일랩	515.01
10 mL 혈청학 피펫	프로파일랩	515.1
서스펜션 배양 전용 100mm 접시	코 닝	C351029
15 mL 원심분리기 튜브	시그마- 알드리치	CLS430791-500개
5 mL 혈청학적 피펫	프로파일랩	515.05
6웰 플레이트	코 닝	CLS3516
세포 배양 플라스크, 표면적 25cm 정사각형	시그마- 알드리치	CLS430639-200개

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