레티노산을 이용한 배아체세포(Embryoid body cells into Neural Progenitors)를 이용한 신경전구세포(Embryoid body cells into Neural Progenitors Using Retinoic Acid)

초록

출처: Yang, J., et al. 2차원 및 3차원 배아체에서 마우스 배아 줄기 세포의 레티노산 유도 신경 분화 분석. J. Vis. 특급. (2017).

이 영상은 레티노산과 행잉 드롭 배양법을 이용하여 줄기세포를 신경전구세포로 분화시키는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

1. 마우스 배아 섬유아세포(MEF)의 배양

1. 15% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM, 고포도당)인 MEF 배지를 준비합니다.
2. 100mm 세포 배양 접시를 0.5% 젤라틴 용액으로 실온(RT)에서 30분 동안 코팅합니다.
3. 세포분석기를 사용하여 MEF를 계산합니다. 젤라틴 용액을 제거하고 37°C로 예열된 MEF 매체를 즉시 붓습니다. 미토마이신 C 처리 MEF의 바이알을 37°C 수조에서 2분 동안 빠르게 해동한 다음 100mm 젤라틴 코팅 접시당 2.8^{x 10 6} MEF를 파종합니다. 다른 크기의 접시를 사용하는 경우 그에 따라 셀 번호를 조정하십시오. 37°C, 5% CO₂에서 밤새 MEF를 배양합니다.
4. 다음 날 매체를 변경합니다. MEF 계층이 합류할 때까지 2-3일 동안 배양합니다.

2. 마우스 배아 줄기 세포 또는 ESC 배양

1. 15% FBS 및 10³ U/mL 백혈병 억제 인자(LIF), 0.1mM 비필수 아미노산, 55mM 2-메르캅토에탄올, 페니실린(100 U/mL), 스트렙토마이신(100 μg/mL), 겐타마이신(200 μg/mL) 및 0.2% 마이코플라스마 항생제가 보충된 ESC 배지(IMDM)를 준비합니다.
2. 1단계에서 준비한 접시에서 MEF 배지를 제거하고 37°C의 예열 ESC 배지로 교체합니다.
3. ESC 바이알을 해동하고 MEF 층 위에 세포를 시드합니다. ESC가 합류점에 도달할 때까지 37°C, 5% CO₂에서 배양합니다.
4. MEF의 합류 단층을 포함하는 새로운 세포 배양 접시를 준비합니다. ESC를 통과시키려면 PBS로 한 번 세척하고 0.25% 트립신/EDTA로 37°C, 5% CO₂에서 2-5분 동안 분리합니다. 분리하는 세포에 15% FBS가 포함된 새로운 IMDM을 첨가하여 트립신화를 중단하고, 세포 현탁액을 15mL 튜브로 옮긴 다음 RT에서 5분 동안 160 x g으로 원심분리합니다.
5. 상층액을 제거하고, 새로운 IMDM으로 배아줄기세포를 재현탁시키고, 세포의 1/5을 각각의 새로운 MEF로 코팅된 접시에 배양시킵니다. 세포가 합류점에 도달할 때까지(일반적으로 4-5일) 배양합니다.

3. 젤라틴 코팅 플레이트에서 MEF 및 배양 ESC 회수

1. ECS가 합류점에 도달하면 2.4단계와 같이 0.25% Trypsin/EDTA로 ECS와 MEF를 분리하고, 새로운 IMDM에 세포를 재현탁하고, 비접착성 세균 페트리 접시로 옮기고, 37°C, 5% CO₂에서 40분 동안 배양합니다.
2. 반복적인 피펫팅을 피하면서 5mL 피펫을 사용하여 ESC 및 MEF 함유 배지를 새 젤라틴 코팅 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다. 페트리 접시에 남아 있는 세포는 ESC가 부착되지 않기 때문에 MEF입니다.
3. 3-4일마다 ESC를 통과하십시오. 덜 빈번한 통과는 ESC 다능성을 감소시킬 수 있습니다. 60% 합류점을 초과하면 차별화에 유리할 수 있으므로 영향을 주지 마십시오.
4. 20X 대물렌즈를 사용하여 세포 배양 현미경에서 MEF를 더 이상 검출할 수 없을 때까지 필요에 따라 3.2-3.3단계를 세 번 이상 반복하여 MEF가 없는지 확인합니다.
5. 세포가 전형적인 ESC 다각형 형태를 가진 조밀한 콜로니를 형성하는지 확인하기 위해 ESC 배양을 확인하여 ESC 다능성을 확인합니다(그림 1A). 정량적 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR), 면역 블로팅 또는 핵심 다능성 전사 인자의 면역 형광을 통해 세포 줄기를 테스트합니다(그림 2).

4. EB 형성

1. DMSO에서 10mM의 all-trans-RA 스톡 용액을 준비하고 1.5mL 광 보호 마이크로분리 튜브로 분취합니다. 이 솔루션은 -80°C에서 최대 2주 동안 안정적입니다. 빛으로부터 보호하십시오.
2. 2.4단계에서와 같이 ESC를 트립신화합니다. LIF가 없는 새로운 IMDM을 단일 세포 현탁액으로 재플레이팅합니다.
3. 혈구계를 사용하여 세포 수를 세고 0.5μM RA로 IMDM에서 5 x 10⁵ cells/mL 현탁액을 준비합니다.
4. 8채널 피펫과 200μL 팁으로 100mm 페트리 접시당 20μL 방울 100개를 플레이트화하고, 접시를 뒤집고, 거꾸로 된 뚜껑을 PBS로 채워 매달린 방울이 마르지 않도록 합니다. RA를 함유한 배양 배지를 빛으로부터 보호합니다.
5. 4 일 동안 37 ° C, 5 % CO₂ 에서 매달려 방울에 떨어 뜨리는 배양 EB.

결과

그림 1 : Sprout 3D 문화에서 Syx^+/+ 및 Syx^-/- EBS의 출현. (A) Syx^+/+ 및 Syx^-/- ESC는 신경 분화가 유도되기 전에 군집된 군체에서 성장했습니다. (B 및 C) 0.5μM RA로 행잉 드롭으로 형성된 EB의 이미지, 그런 다음 RA 없이 3D 콜라겐 매트릭스에 삽입되었습니다. 이미지는 표시된 대물렌즈(스케일 바 = A 및 C에서 100μm, B에서 200μm)에 의해 6일차에 캡처되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
자료
MEF	EMD 밀리포어	PMEF-CF	ESC 피더 레이어
ESC	EMD 밀리포어	CMTI-2
세포 배양 접시 (60mm)	에펜도르프	30701119	세포 배양
세포 배양 접시 (100mm)	송골매	353003	세포 배양
페트리 접시 (100mm)	코 닝	351029	매달린 방울
어두운 1.5ml 원심분리기 튜브	Celltreat Scientific 제품	229437	RA 스톡 솔루션
현미경 커버 - 유리	피셔브랜드	제12-545-80	원형, 직경 12mm
Superfrost-plus 현미경 슬라이드	피셔브랜드	제12-550-15
시약
DMEM을 참조하십시오.	론자	12-709층	MEF 문화권
국제경영시스템(IMDM	지브코	제12440-046	배아줄기세포 문화
소 태아 혈청(FBS)	EMD 밀리포어	ES-009-B	배아줄기세포 문화
젤라틴	시그마-알드리치	G2625	식기 코팅
리프	R&D 시스템	8878-LF-025	ESC 다분화능을 유지하기 위해
MEM 비필수 아미노산 용액	지브코	11140050	세포 배양
2-메르캅토에탄올	지브코	21985023	세포 배양
페니실린-스트렙토마이신	지브코	15140122	세포 배양
겐타마이신	지브코	15750060	세포 배양
MycoZap 플러스-PR	론자	VZA-2022	세포 배양
0.25% 트립신-EDTA	지브코	제25200-072	세포 배양
디엠소	시그마-알드리치	D2650
모든 트랜스 레티노산	시그마-알드리치	R2625-50MG	신경 분화 유도
PBS (PBS)	지브코	10010049
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광시야 현미경	니콘	이클립스 TS100	세포 배양 이미징