희소돌기아교세포 전구세포에 대한 체외 형질도입 유도 수초화 분석

초록

출처: Peckham, H. M., et al. 체외 수초화 분석을 위한 일차 희소돌기아교세포 전구세포를 선택적으로 형질도입하기 위한 렌티바이러스의 생산 및 사용. J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오는 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)를 희소돌기아교세포로 분화하고 배근신경절(DRG) 뉴런과 공동 배양에서 수초화를 유도하는 프로토콜을 보여줍니다. OPC는 수초화를 조절하는 신호 단백질을 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질전환됩니다. 형질도입된 OPC는 DRG 뉴런과 공동 배양되어 희소돌기아교세포로의 분화 및 신호 단백질 유도 수초화를 평가합니다.

프로토콜

1. 2K7 렌티벡터 클로닝

1. 관심 유전자를 2K7 렌티바이러스 벡터에 클로닝하기 전에 표준 분자 기술을 사용하여 유전자를 pENTR 벡터(3637 bp, 카나마이신 내성)로 서브클론합니다. 서브클로닝을 위해 EcoRI 및 SacII 제한 부위를 사용합니다.
2. 2K7 렌티벡터의 증폭
   1. 100ng의 플라스미드 DNA를 적격 세포와 부드럽게 혼합하여 2K7 렌티벡터 DNA를 변형시키고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
   2. 열 충격 DNA/수용 세포는 42°C에서 90초 동안 혼합하고 16-18시간 동안 37°C에서 암피실린(100μg/ml)과 클로람페니콜(15μg/ml)을 모두 포함하는 LB-Agar 플레이트에 플레이트합니다.
      참고: 클로람페니콜은 긴 단자 반복 사이의 재결합을 방지하는 데 사용됩니다.
   3. 다음날, 암피실린(100μg/ml)과 클로람페니콜(15μg/ml)을 모두 함유하는 Luria-Bertani(LB) 배지에서 16-18시간 동안 37°C에서 선별된 박테리아 클론을 성장시킵니다.제조업체의 지침에 따라 상용 플라스미드 DNA Maxiprep 키트를 사용하여 DNA를 추출합니다.
3. pENTR 벡터에서 2K7 Lentivector로의 서브클로닝(그림 1).
   1. L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV (promoter) (60 bng)1-2.5 μl L1-L2 pENTR4IRES2GFP (관심 유전자 포함) (80 bng)1-2.5 μl K7 렌티벡터 (80 ng/μl)1 μl TE-완충액, pH 82-5 μl.총 8 μl.
   2. 클로나제 효소 혼합물을 -80°C에서 제거하고 얼음에서 2분 동안 해동합니다. 이 효소는 -80°C에서 새로운 부분 표본인지 확인합니다. 이 효소는 반복적인 동결-해동 주기로 클로닝 효율을 크게 감소시켰으므로 이 효소가 -80°C의 새로운 부분 표본인지 확인합니다
   .
   3. 반응 당 2 μl의 효소를 추가하고 와류를 통해 잘 혼합하고 클로 나제 반응 혼합물을 23-25 °C에서 6-24 시간 동안 배양합니다.
   4. 클로나제 반응 혼합물에 1μl의 proteinase K 용액(효소 키트와 함께 제공됨)을 추가하고 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
   5. 클로나제 반응 혼합물을 수용 세포로 형질전환하고 16-18시간 동안 37°C에서 암피실린(100μg/ml)을 함유하는 LB 배지에서 선택된 콜로니를 성장시킵니다.
   6. 제조업체의 지침에 따라 상용 플라스미드 DNA Miniprep 키트를 사용하여 DNA를 추출하고 정제합니다.
   7. 제한 효소 Spe I 및 Sac II를 사용하여 분해를 통해 DNA를 확인하고 프로모터와 관심 유전자를 포함하는 단편을 제거하라는 제조업체의 지침에 따라 적절한 완충액을 사용합니다.
      참고: 이 단계는 subclone된 DNA가 올바른 벡터 backbone을 가진 올바른 삽입 유전자를 가지고 있는지 확인하는 데 중요합니다. 삽입된 fragment가 없는 벡터 자체의 크기는 6.7kb입니다. 방출된 삽입된 단편의 크기는 관심있는 프로모터와 삽입 유전자를 모두 포함한다. DNA 염기서열 편집 프로그램(예: APE-A Plasmid Editor)을 통해 특정 유전자에 대한 다이제스트에서 예상되는 단편 크기를 계산합니다.
   8. 100V에서 1x TAE 버퍼(표 1 참조)에 1% 아가로스 겔을 실행하여 DNA 벡터 골격과 방출된 단편의 크기를 모두 확인합니다.
   9. 암피실린(100μg/ml)을 함유한 500ml의 LB 배지에서 16-18시간 동안 37°C에서 박테리아를 배양하여 확인된 DNA를 증폭합니다.
   10. 제조업체의 지침에 따라 상용 플라스미드 DNA Maxiprep 키트를 사용하여 DNA를 추출하고 정제합니다.
       메모: Maxiprep은 일반적으로 바이러스 생산에 필요한 충분한 양의 DNA를 생성합니다.
4. 1.3.9-1.3.10 단계를 반복하여 렌티바이러스 제제를 위한 다음 DNA를 증폭합니다. G, 6.1 kb), 패키지 벡터(pBR8.91, 12.5 kb) 및 빈 렌티바이러스 벡터를 대조군(GFP-CMV-2K7, 8.7 kb)으로 사용할 수 있습니다.

2. 2K7 바이러스 생산

참고: 1일차:

1. transfection 당일, 25ml HEK(Human Embryonic Kidney) 293 T 세포 배지를 포함하는 T175 플라스크에 3,200만 개의 HEK293 T 세포를 플레이트화합니다(표 1 참조). 또는 transfection 당일에 시간이 촉박한 경우 transfection 전날 1,600만 개의 세포를 plateplate합니다.
   메모: Transfection은 Transfection 당일 또는 그 전에 세포를 도금함으로써 동등하게 성공할 수 있습니다. 두 가지 대안 중 하나를 사용할 경우, 여기서 중요한 점은 transfection.
   전에 세포가 배양 접시 표면에 고정되어 있는지 확인하는 것입니다. 메모: 2일차:
2. 형질주입(Transfection)
   1. 형질주입하기 전에 탈이온수에 10mM Tris pH 8, 1mM EDTA pH 8을 포함하는 Tris-ethylenediaminetetraacetic acid(TE) 완충액에서 DNA를 1μg/μl로 희석합니다.
   2. 50ml 튜브에 T175 플라스크에서 transfection을 위한 마스터 믹스(표 2)를 준비합니다. 예열된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에 DNA를 첨가하고 와류로 잘 혼합한 다음 멸균 폴리에틸렌이민(PEI)을 첨가합니다(조기 침전을 피하기 위해 표 1 참조).
   3. 튜브를 3-4x 뒤집어 잘 섞고 실온(RT)에서 15분 동안 배양합니다.
   4. HEK293T 셀에서 전체 미디어 변경을 수행합니다. 세포에서 배양 배지를 완전히 흡입하고 예열된 HEK293T 세포 배양 배지(T175 플라스크당 25ml)를 공급합니다.
   5. transfection 혼합물(DNA/PEI 혼합물)을 단층 세포에 적가합니다. 부드럽게 움직여 잘 섞이고 형질주입된 세포를 37°C, 5% CO2에서 하룻밤 동안 배양합니다.
      참고: 3일차:
   6. transfection이 성공적인지 확인하려면 형광 현미경을 통해 transfection 후 24시간 후에 녹색 형광 단백질(GFP) 발현을 확인합니다.
      메모: GFP를 발현하는 세포의 50% 이상이 일반적으로 양호한 transfection을 나타냅니다.
      메모: 4일차:
3. transfection 후 48시간이 지나면 바이러스 상층액을 채취하여 새로운 HEK293 T 배지(T175 플라스크당 25ml)로 교체합니다.
   1. 바이러스 상층액을 1,140 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 상층액에서 세포 파편을 제거합니다. 세척된 상등액을 50ml 튜브에 옮기고 4°C에서 보관합니다.
      참고: 5일차:
4. transfection 후 72시간이 지나면 두 번째 바이러스 상층액을 채취합니다. 2.3.1단계를 반복하고 48시간 및 72시간 동안 제거된 상층액을 풀링합니다.
5. 바이러스를 농축하기 위해 30ml 초원심분리기 튜브를 사용하여 170,000 x g에서 4°C에서 90분 동안 바이러스 상등액을 원심분리합니다.
6. 상층액을 버리고 투명화된 모든 상등액이 원심분리되어 (보이지 않는) 바이러스 펠릿과 튜브 바닥에 침전된 PEI가 남을 때까지 2.6단계를 반복합니다.
7. 바이러스를 재현탁시키려면 초원심분리 튜브에 500μl SATO 배지(표 1 참조)를 추가합니다. 30초 동안 소용돌이치고 피펫 팁으로 튜브 바닥을 긁어 바이러스를 기계적으로 풀어줍니다. 바이러스 펠릿을 잃기 위해 이 단계를 6번 반복합니다.
8. 재현탁한 바이러스를 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 아주 짧게 돌려 불용성 PEI를 제거합니다. 0.45μm 필터를 통해 상층액을 여과하여 단백질을 제거합니다.
9. 바이러스를 20 μl, 50 μl, 100 μl 분취량으로 나누어 -80 °C에서 보관합니다.

3. OPC 변환

1. 섬모 신경 영양 인자 (CNTF, 10 ng / ml), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF, 10 ng / ml), 신경 영양 호르몬 3 (NT3, 1 ng / ml) 및 포스콜린 (4.2 μg / ml)과 함께 SATO 배지 (10ml / 10cm 플레이트)에서 1 차 OPC를 배양, 37 ° C, 해부 후 24 시간 동안 8 % CO₂
.
2. OPC 배양 배지를 완전히 흡인하고 성장 인자와 함께 갓 만든 SATO 배지(10ml)를 세포에 공급합니다(위의 3.1단계 참조).
3. OPC에 바이러스를 최적의 농도로 첨가하고 추가로 48시간 동안 OPC를 배양합니다.

4. 수초화 공동 배양을 위한 OPC 시딩(그림 2)

1. 표면에서 OPC를 제거하려면 먼저 8ml Earle's Balanced Salt Solution(EBSS)으로 OPC 플레이트를 두 번 헹구고 37°C에서 2분 동안 EBSS로 1:10으로 희석된 따뜻한 0.05% Trypsin-EDTA 5ml로 세포를 배양합니다.
2. EBSS (5 ml)에 있는 30% FBS를 가진 트립신을 중화하고 피펫팅에 의해 판에서 세포를 제거하십시오. 세포 현탁액을 15ml 튜브로 옮기고 RT에서 15분 동안 180 x g에서 원심분리합니다.
3. 상층액을 흡인하고 1ml의 예열된 SATO 배지에 세포 펠렛을 재현탁시킨 다음 세포 수를 계산합니다.
4. OPC 파종 전에 DRG 배양 플레이트에서 배지를 완전히 흡입합니다. 앞에서 설명한 대로 200,000개의 OPC를 DRG 뉴런에 부드럽게 시딩합니다.
   메모: 총 OPC 파스딩 부피는 22mm 커버슬립당 200μl 미만이어야 합니다.
5. 조직 배양 후드에서 10분 동안 플레이트를 움직이지 않고 세포가 가라앉도록 방치한 다음 웰당 1ml의 예열된 SATO 배지를 부드럽게 채웁니다.
6. 나머지 자매 OPC를 성장 인자를 가진 SATO 배지로 다시 플레이팅합니다(6.1단계 참조). 이러한 자매 OPC를 사용하여 관심 단백질의 발현을 확인할 수 있습니다.
7. 24시간 후, SATO 배지를 SATO 배지(인자 없음)와 1% B2로 neurobasal(v/v)을 포함하는 공동 배양 배지(2ml/well)로 교체하십시오.2-3일마다 배지를 교체하면서 14일 동안 공동 배양을 유지합니다.
8. 웨스턴 블롯 분석을 통해 미엘린 단백질 발현을 위한 공동 배양을 평가하고 미엘린 염기성 단백질 마커 및 뉴런 마커에 대한 항체를 사용한 이중 면역염색을 통해 수초화된 축삭 분절의 형성을 시각화합니다.

결과

표 1. 재고 솔루션 테이블.

이름	재료	노트
TE 완충액 pH 8	10mM 트리스 pH 8 1mM EDTA 산도 8	탈이온수로 메이크업하십시오.
폴리에틸렌이민(PEI)	1g/L	탈이온수로 구성하고 여과 살균하여 -20 °C에서 재고를 보관하십시오.
LB 미디엄	트립톤 20g 효모 추출물 10g...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2K7 렌티벡터			수터 박사의 친절한 선물
5-플루오로-2'-데옥시우리딘	시그마-알드리치	F0503-100mg
암피실린	시그마-알드리치	A9518-5G
B27 - NeuroCul SM1 신경 보충제	줄기세포 기술	5711
BDNF (인간)	페프로텍	PT450021000
비오틴(d-비오틴)	시그마-알드리치	나4639
증권 시세	시그마-알드리치	A4161
클로람페니콜	시그마-알드리치	C0378-100G
증권 시세	페프로텍	Tel.: 450-13020
DAKO 형광 마운팅 미디어	다코	S302380-2
DMEM, 고포도당, 피루브산, 글루타민 무함유	생명 기술	10313039
DNase	시그마-알드리치	D5025-375구
디피에스	생명 기술	14190250
DPBS, 칼슘, 마그네슘	생명 기술	14040182
증권 시세	생명 기술	14155063
에코리-HF	넵	R3101
promoter 및 gene of interest에 대한 entry vectors			프로토콜 1-2에 따라 생성
소 태아 세럼	시그마-알드리치	12003년
포스콜린	시그마-알드리치	F6886-50MG
포도당(D-포도당)	시그마-알드리치	G7528 (영문
글리세롤	화학 공급	GL010-500M	재고 솔루션 보기

년 표시기 표시기 표시기 )