쥐의 뇌에서 형광 표지된 뉴런 분리

초록

출처: Paul, A., et al., 수동 정렬 및 절대 카운트 염기서열 분석을 사용한 이중 체외 전사를 사용한 형광 표지 마우스 뉴런의 단일 세포 RNA 염기서열 분석(DIVA-Seq). J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오는 쥐의 뇌에서 형광 표지된 뉴런을 분리하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 형광 표지된 마우스 뉴런의 수동 정렬

1. 다음 설정으로 모세관 풀러를 사용하여 유리 미세 모세관(재료 표 참조)을 10–15μm 출구 직경으로 당깁니다: heat: 508, pull: blank, vel: blank, time: blank.
2. 적절한 튜빙 커넥터를 사용하여 120–150cm 유연한 실리콘 튜브(내경 ~0.8mm)를 0.2μm 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인 실린지 필터와 양방향 튜빙 밸브에 부착합니다.
3. 냉각된(4°C) 인공 뇌척수액(ACSF, 표 1) 500mL를 준비하고 15분 동안 또는 용액이 완전히 제거될 때까지 에어스톤을 통해 5% 이산화탄소 균형 산소를 버블링하여 산소를 공급합니다.
4. 150mL 비커에 활성 차단제 칵테일과 함께 ACSF 100mL를 준비합니다(표 1).
5. 150mL 비커에 1mg/mL 연쇄상구균 분획 IV 프로테아제와 함께 ACSF 100mL를 준비합니다(표 1).
6. 150mL 비이커에 1% 소 태아 혈청(FBS) 용액이 함유된 ACSF 100mL를 준비하고 에어스톤을 통해 5% 이산화탄소 균형 산소로 산소를 공급합니다.
7. 안락사된 쥐의 뇌를 작은 가위로 열고 피질을 손상시키지 않고 미세한 집게를 사용하여 신선한 뇌를 추출하여 뇌를 해부합니다.
   메모: 모든 균주, 연령 및 성별의 마우스를 원하는 대로 사용할 수 있습니다. 바이러스 또는 기타 위험/감염원이 주입된 마우스에서 뇌를 동결하거나 수동 분류를 수행하지 마십시오.
8. 뇌를 차갑고 산소가 공급된 ACSF 상태로 유지하고, 절편이 진행되는 동안 5% 이산화탄소 균형 산소에 부착된 에어스톤을 남겨둡니다.
9. 뇌를 비브라톰 척에 놓고 300μm 두께로 관상동 또는 시상 절편을 자릅니다. 최소 10~50개의 라벨링된 세포에서 최대 수백 개의 세포를 얻기 위해 필요한 만큼 절편을 수집합니다. 솜 그물망 슬라이스 홀더에 슬라이스를 넣고 비커 안에 넣어 산소가 공급된 ACSF로 목욕시킵니다.
10. 새로운 슬라이스를 활성 차단제가 있는 ACSF가 들어 있는 비커로 옮기고 실온에서 15-20분 동안 차단합니다. 에어스톤을 사용하여 산소를 계속 거품을 일으키십시오.
11. 프로테아제 용액이 든 ACSF가 들어 있는 비커로 슬라이스를 옮겨 실온에서 가벼운 소화를 수행합니다(P4-14 동물의 경우 20-30분, P28-56 동물의 경우 최대 45-60분). 산소가 계속 부글부글 끓고 있습니다.
12. 실온에서 5-10분 동안 활성 차단제 용액이 포함된 ACSF가 들어 있는 비커로 슬라이스를 다시 이동하여 프로테아제로 ACSF를 세척합니다. 산소가 계속 부글부글 끓고 있습니다.
13. 실온에서 FBS 1%가 포함된 ACSF가 포함된 100mm 페트리 접시로 개별 섹션을 이동합니다. 형광 해부 범위에서 최소 10-50개의 세포(최대 수백 개)를 갖는 관심 영역과 층을 미세 해부합니다. 한 쌍의 미세한 집게를 사용하거나 22-28G의 주사 바늘을 나무 홀더(꼬챙이)에 부착하여 현저해부를 수행합니다.
14. 파스퇴르 피펫을 사용하여 미세해부된 조각을 ACSF 용액에 ~0.8mL의 1% FBS가 들어 있는 2mL 마이크로분리 튜브로 이동합니다.
15. 실온에서 마이크로분리 튜브에서 절개된 조직을 분쇄합니다. 줄기가 긴 파스퇴르 피펫 3개를 화염 위로 굴려 출구 직경을 줄이는 것으로 만듭니다. 각 파이펫에 대해 가장 큰 것부터 시작하여 가장 작은 것부터 끝까지 ~10 스트로크를 수행합니다.
16. 산소가 공급된 ACSF가 포함된 100mm 페트리 접시에 해리된 세포를 분배합니다(페트리 접시는 원하는 경우 1:10 비율로 5mm의 1% 한천 또는 투명 실리콘 화합물로 얇게 코팅할 수 있음). 실온에서 보관하십시오.
17. 세포가 점차적으로 정착할 때까지 ~5-7분 정도 기다린 다음 해부 현미경으로 GFP/RFP 신호를 관찰합니다.
    메모: 단일 세포, 파편 및 작은 덩어리는 명시야(BF)에서 볼 수 있습니다.
18. 유연한 실리콘 튜브(내경 0.4–0.8mm)에 부착된 모세관 피펫(1.1단계)을 사용하여 한 번에 10–15개의 GFP/RFP 세포를 선택하고 산소가 공급된 신선한 ACSF가 들어 있는 100mm 페트리 접시에 세포를 분배합니다.
19. 튜빙 밸브의 끝을 텅(tongue)으로 막아 모세혈관을 관심 세포에 가깝게 배치합니다. 블록을 해제할 때 모세관 작용을 사용하여 세포를 포획하고 과도한 액체가 피펫으로 유입되는 것을 방지하기 위해 신속하게 다시 차단합니다. 산소가 공급된 신선한 ACSF가 담긴 100mm 페트리 접시에 세포를 부드럽게 불어 넣으면서 해부 현미경의 형광 광학 장치 아래에서 모세관 팁을 관찰합니다. 총 ~100-150개의 셀을 수집하는 것을 목표로 합니다.
20. 1.19단계를 한 번 또는 두 번 더 반복하고(파편에 따라 다름) 총 ~50–75개의 셀을 새 100mm 페트리 접시로 옮겨 명시야 미분 간섭 대비(DIC) 광학 장치에서 파편과 같은 오염 물질이 최소화되도록 합니다.

표 1: 솔루션 및 버퍼 목록.

의 의 .

완충기	항목	농도	양(μL)
Sample Collection 버퍼	재조합 리보뉴클레아제 억제제		55
	RCC (영어)	1:50K 희석	110
	뉴클레아제 무함유 물		605
	위의 43.75 μL를 16개의 튜브(8개의 스트립 2개, 200 μL PCR 튜브)로 분취량, 튜브당 다음을 추가합니다.
	UMI 프라이머 (예: N10B1-N10B16)	1 ng/μL	6.25 μL/튜브
	각 튜브의 최종 부피 50 μL (각 튜브는 25 μL 분취량으로 분할하고 -80 °C에서 동결 가능)
솔루션:	항목	농도	분량
CSF: 5L를 녹이기 위해	염화나트륨	126 밀리미터.	36.8 지
	케이클	3 밀리엠	1.15 지
	나H2PO4	1.25 밀리미터.	0.75 지
	나HCO3	20 밀리미터미터	8.4 지
	ACSF 500mL에 10-15분 동안 산소를 거품을 일으킨 다음 매번 다음을 새로 추가합니다.
	D-포도당	20 밀리미터미터	1.8 지
	재질 보기 MgSO4	2 밀리엠	4 M 재고에서 0.5 mL
	염화칼슘2	2 밀리엠	4 M 재고에서 0.5 mL
	ACSF에 산소를 공급하십시오
솔루션:	항목	집중
활동 차단 칵테일: 100배 스톡 만들기
	100mL ACSF에 추가
	APV (자작위)	0.05 밀리미터.
	씨엔큐엑스	0.02 밀리미터미터
	티엑스	0.0001mM(0.1μM)
솔루션:	항목	분량
프로테아제 용매(100mL)	Streptomyces griseus의 프로테아제	100의 mg의
태아 소 혈청: 상업용 소스, 각 용도에 대해 500μL의 분취량.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DL-AP5	토크리스	고양이# 0105
씨엔큐엑스	토크리스	고양이# 1045
티엑스	토크리스	고양이 # 1078
Streptomyces griseus의 프로테아제	시그마-알드리치	고양이# P5147
카보겐	에어가스	고양이# UN3156
실가드 184	시그마-알드리치	고양이# 761036
DIC 광학 장치를 사용한 형광 및 명시야 조명을 사용한 해부 현미경. (라이카 모델 MZ-16F).	라이카	모델 MZ-16F
유리 미세 모세관: 붕규산 모세관 500/pk. OD=1mm, ID=0.58mm, 벽=0.21mm, 길이=150mm.	워너 악기	모델 GC100-15, 주문# 30-0017
모세관 피펫 풀러	셔터 인스트루먼트 공동	P-97
비브라톰	써모 마이크로미터	흠 650V
Vibratome 조직 냉각 장치	써모 마이크로미터	CU 65