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1. OL 계통(OL) 세포 수확 및 배양
참고: 이 단계는 멸균 조건의 층류 후드에서 수행해야 합니다.
- 진탕 후 당일, 표 1에 따라 Bottenstein-Sato (BS) 배지를 준비합니다.
- 코팅된 페트리 접시를 멸균 증류수로 3번 헹굽니다.
- 주로 OL 계통 세포뿐만 아니라 일부 미세아교세포를 포함하는 플라스크의 상등액을 수확하고 코팅되지 않은 100mm 페트리 접시에 도금합니다.
메모: 이 단계를 통해 접시 표면의 차등 고속 접착을 통해 미세아교세포를 제거할 수 있습니다.
- 페트리 접시를 37°C의 가습 인큐베이터에서 5% CO2 이하로 15분 동안 배양합니다.
- 각 T150 플라스크에 갓 준비한 따뜻한 배양 배지 25mL를 채우고 두 번째 진탕할 때까지 37°C의 5% CO2 이하로 가습된 인큐베이터에서 배양합니다.
- 페트리 접시의 상층액을 코팅되지 않은 새로운 100mm 페트리 접시로 옮겨 잔류 미세아교세포의 접착을 허용합니다.
- 페트리 접시를 37°C의 가습 인큐베이터에서 5% CO2 이하로 15분 동안 배양합니다.
- 비부착성 OL 계통 세포를 포함하는 상등액을 제거하고 50mL 튜브(50mL 튜브의 경우 2개의 페트리 접시에서 추출한 상등액)로 옮깁니다. 미세아교세포로 도금된 페트리 접시는 버리십시오.
- 상층액을 423 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 조심스럽게 제거하고 세포 펠릿을 1mL의 BS 배지로 재현탁합니다. 모든 펠릿을 일반적인 50mL 튜브에 모으고 BS 배지를 사용하여 부피를 10mL로 조정합니다.
- 현미경으로 세포를 계수하여 세포 밀도를 측정합니다.
메모: 3 x 105 cells/mL 및 5 x 105 cells/mL 사이의 세포 밀도를 얻어야 합니다.
- 세포 밀도가 4 x 105 cells/mL 이상인 경우 BS 20mL를 추가하여 최종 부피 30mL를 얻고, 세포 밀도가 4 x 105 cells/mL 미만인 경우 BS 10mL만 추가하여 최종 부피 20mL를 얻습니다.
- 사전 코팅된 100mm 페트리 접시 2개 또는 3개를 10mL의 세포 현탁액으로 플레이트에 넣습니다. 37 ° C의 가습 인큐베이터에서 5 % CO2 이하로 배양하십시오.
- 2시간 후에 모든 BS 매체를 새로 고침하여 페트리 접시의 잔여물을 제거합니다.
메모: 세척 전후에 현미경으로 배양물을 검사하여 세포 밀도와 잔해 제거 효율성을 확인합니다.
- 37°C의 가습 인큐베이터에서 BS 배지에서 5% CO2.
이하로 2일 동안 배양합니다.
메모: 현미경으로 배양을 검사하십시오. 합류점은 70%에서 80%여야 합니다.
2. OCM 제작
참고: 멸균 조건의 층류 후드에서 다음 단계를 수행하십시오.
- 표 27에 따라 NB-B27low 매체를 준비합니다.
- 따뜻한 NB-B27low 배지 10mL로 배양 배지를 갱신합니다. 37 ° C의 가습 인큐베이터에서 5 % CO2 이하로 2 일 동안 배양합니다.
- OCM, 즉 OL 분비 인자를 포함하는 상등액을 수확합니다. 0.22μm 필터를 사용하여 OCM을 필터 멸균합니다.
메모: OCM은 4°C에서 최대 2개월 동안 보관하십시오.
표 1: 보텐슈타인-사토(BS) 매체 준비.
| 보텐슈타인-사토(BS) 미디어 | 최종 집중 |
| 둘베코의 변형된 독수리 매체 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 100 IU / mL |
| apo-Transferrin 인간 | 100 μg/mL |
| BSA (소 혈청 알부민) | 100 μg/mL |
| 인슐린 | 5 μg/mL |
| PDGF (영문) | 10 ng / mL |
| 프로게스테론 | 62 ng / mL |
| Putrescine dihydrochloride | 16 μg/mL |
| 아셀렌산나트륨 | 40 ng / mL |
| T3 (3,3', 5-Triiodo-L-thyronine 나트륨 염) | 30 ng / mL |
| T4 (L-티록신) | 40 ng / mL |
표 2: NB-B27low 및 NB-B27 미디어 준비.
| NB-B27 로우 미디어 | 최종 집중 |
| 뉴로기저 | |
| B27 보충제 | 0.5배 |
| L-글루타민 | 0.5 밀리미터. |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 100 IU / mL |
| NB-B27 미디어 | 최종 집중 |
| 뉴로기저 | |
| B27 보충제 | 1배 |
| L-글루타민 | 0.5 밀리미터. |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 100 IU / mL |