신경 세포 배양을 위한 콜라겐 코팅 구획 배양 접시의 준비

초록

출처: Zepecki, J. P., et al. 배근 신경절 축삭돌기아교-희소돌기아교세포 공동 배양에서 인간 신경교종 세포 이동의 실시간 모니터링. J. Vis. 특급 (2019년)

이 동영상은 콜라겐과 무반응성 그리스를 사용하여 3칸 세포 배양 시스템을 구축하는 방법을 보여줍니다. 이 시스템은 신경교종 세포와 축삭돌기 사이의 상호 작용을 실시간으로 관찰하는 데 사용됩니다.

프로토콜

1. Rat Dorsal Root Ganglia(DRG), 희소돌기아교세포(OPC) 및 hGC(인간 신경교종 세포)의 구획 배양

1. 구획 배양 요리 준비

참고: DRG의 계획된 수확 며칠 전에 다음 단계를 수행합니다.

1. 구획화된 문화 접시를 조립하십시오.
2. 콜라겐 스톡 용액을 멸균 증류 H₂O에 500 μg/mL로 희석하고 철저히 혼합합니다.
3. 멸균 전사 피펫을 사용하여 35mm 배양 접시에 콜라겐 용액 2mL를 채우고 용액을 제거하고 얇은 콜라겐 필름을 남기고 다음 35mm 접시에 넣습니다. 모든 접시가 코팅될 때까지 필요에 따라 콜라겐 용액을 더 추가하여 이 과정을 반복합니다.
4. 모든 플레이트가 코팅되면 플레이트를 245mm x 245mm 배양 트레이에 넣고 트레이 중앙에 1mm x 1mm 거즈 패드 3개를 놓습니다.
5. 콜라겐을 중합하려면 거즈 패드에 농축 수산화암모늄 1mL를 적시고 트레이를 15분 동안 덮습니다.
6. 거즈 패드를 제거하고 35mm 접시가 층류 후드에서 건조되도록 합니다.
7. 접시가 건조되는 동안 주사기 그리스 어플리케이터의 배럴에 고진공 그리스를 넣습니다. 구획된 챔버를 증류수로 채워진 큰 입 미디어 병에 넣습니다. 둘 다 오토클레이브로 살균하고 식히십시오.
8. 뭉툭한 팁을 만들기 위해 18-G 바늘의 끝을 줄로 깎습니다. 70% 에탄올로 살균합니다. 그리스 주사기에 바늘을 부착합니다.
9. 핀 레이크를 70% 에탄올에 담궈 살균하고 층류 후드에서 자연 건조시킵니다.
10. 콜라겐으로 코팅된 35mm 건조 접시의 뚜껑을 제거합니다. 엄지와 검지 사이에 접시를 잡습니다. 다른 손으로 핀 레이크를 잡습니다. 접시 중앙을 가로질러 200μM 너비의 흠집이 나도록 세게 압력을 가합니다.
11. 목초지 피펫을 사용하여 Supplemented Neuronal Basal Medium 두 방울을 긁힌 자국 중앙에 떨어뜨립니다.
12. 모든 접시가 긁힐 때까지 1.1.10-1.1.11 단계를 반복합니다.
13. 층류 후드에서 구획 챔버를 건조시킵니다.
14. 멸균 지혈 겸자로 중앙 칸막이 옆의 구획된 챔버 하나를 잡습니다. 지혈 겸자를 뒤집어 챔버 바닥이 위를 향하도록 합니다.
15. 격실이 있는 챔버에 위에서부터 시작하여 실리콘 그리스를 바릅니다. 그리스가 깔끔하게 배치되고 모든 모서리가 겹치는지 확인하십시오.
16. 35mm 접시에서 뚜껑을 제거합니다. 접시를 뒤집고 챔버 위에 흠집을 놓습니다. 집게로 접시 바닥을 부드럽게 두드립니다.
17. 지혈 겸자를 사용하여 플레이트를 부드럽게 뒤집습니다. 겸자를 놓습니다.
18. 중앙 구획의 바닥에 기름 더미를 놓습니다. 각 챔버를 Supplemented Neuronal Basal Medium(NB)으로 채우고 누출이 있는지 확인합니다. 필요에 따라 실리콘 그리스로 누출을 막습니다.
19. 모든 배양 접시를 계속 조립하고 37°C, 5% CO₂에서 하룻밤 동안 보관하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
세포 배양 접시	코 닝	430165	35mm x 10mm
피하 주사 바늘, 18G	BD (영어)	511097
수산화암모늄 용액	피셔 사이언티픽	A669-500	집중
세포 배양 접시	코 닝	430165
캄페노 챔버	타일러 리서치	캠프-10
지혈 겸자	로보즈	RS-7035
컬트렉스 랫 콜라겐 I	트레비겐	Tel.: 3440-100-01
핀 레이크	타일러 리서치	캠프 홍보
Neurobasal 배지	써모 피셔	21103049
실리콘 그리스
금속 파일
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사
CO2 인큐베이터
유리 피펫