신경 능선 세포 배양을 위해 병아리 배아에서 두개골 신경 주름 분리

초록

출처: Jacques-Fricke, B. T., et al. 병아리 두개골 신경 능선 세포 배양의 준비 및 형태 학적 분석. J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 병아리 배아의 중뇌 영역에서 두개골 신경 주름을 분리하는 기술을 보여줍니다. 신경 주름의 상세한 해부 과정, 그 위치 및 피브로넥틴으로 코팅된 커버슬립에 부착된 후 신경 주름에서 신경능선 세포의 이동을 관찰합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 용액 및 재료 준비

1. 123.3 mM NaCl, 1.53 mM CaCl₂ , 4.96 mM KCl, 0.809 mM Na₂HPO₄ 및 0.147 mM KH₂PO₄ 를 혼합하여 Ringer 용액을 준비합니다 (재료 표 참조). pH를 7.4로 조정하고 100mL 병으로 여과 멸균합니다. 깨끗하고 건조한 장소에 보관하십시오. 비누로 병을 씻지 마십시오(조직 배양 유리 제품으로 취급).
2. 멸균 Ringer 용액에 FN을 용해시켜 1mg/mL 원액 피브로넥틴(FN)(재료 표 참조)을 준비하고 -80°C에서 100μL 분취량에 보관합니다(최소 4년 동안 안정).
3. L15 배지에 0.8% L-글루타민, 0.08% 페니실린/스트렙토마이신, 10% FBS 및 10% 병아리 배아 추출물을 보충하여 완전한 배양 배지를 준비합니다. 3mL 부분 표본을 생성하고 -20 °C 또는 -80 °C에서 보관합니다.
   메모: CO₂ 인큐베이터에서 배양물을 배양하는 경우, 공기로 완충되는 L15 대신 Dulbecco의 DMEM/F12(Modified Eagle Medium F12
)를 사용해야 합니다.
4. 여과지 지지 프레임(약 1cm x 1.5cm, 장축에 겹치는 2개 또는 3개의 천공 구멍이 있는 직사각형 용지)을 준비합니다.
   1. 표준 3 구멍 펀치를 사용하여 큰 여과지 조각의 가장자리를 따라 구멍을 뚫고 펀칭 된 가장자리를 스트립으로 자르거나 다듬은 다음 구멍 사이의 스트립을 직사각형 ~ 1.5cm 길이로 자릅니다. 사용하기 전에 오토클레이브 여과지(선택 사항).
5. 가는 집게(#5), 뭉툭한 집게, 해부 가위, 스프링 가위, 날카로운 텅스텐 바늘을 포함한 해부 도구를 수집합니다.

2. 배양 요리 준비

1. 다운스트림 응용 분야에 적합한 신경 주름 배양 접시(재료 표 참조)를 선택합니다.
   1. 고정 및 염색될 배양의 경우 다중 웰 조직 배양 접시에 넣은 유리 커버슬립을 사용하십시오.
      메모: 웰 크기와 일치하는 커버슬립은 유체 혼합으로 덜 움직이므로 외식이 이동할 가능성이 적고 접시 바닥보다 커버슬립에 부착될 가능성이 더 높습니다.
   2. 유리 바닥의 단일 챔버 또는 분할된 챔버 접시(Table of Materials(재료 표 참조)를 선택하여 도립 현미경을 사용한 실시간 이미징을 수행할 수 있습니다.
   3. 정립 현미경 또는 실체 현미경에서 라이브 이미징을 수행하려면 광학적으로 적합한 6웰, 12웰 또는 24웰 조직 배양 플레이트를 사용하십시오.
   4. 고처리량 분석을 위해 이동하는 신경능선세포(Neural crest cell)의 대량 수집을 위한 플라스틱 조직 배양 접시를 선택하십시오.
2. 100mL의 멸균 Ringer's 용액 병에 페니실린 10U/mL와 스트렙토마이신 10μg/mL를 추가합니다(예: Ringer's P/S를 만들기 위해 1000μL의 10,000U/mL 페니실린 및 10,000μg/mL의 스트렙토마이신). 1주일 이내에 Ringer's P/S를 사용하십시오.
3. 1mg/mL의 FN 분취액을 얼음에 적어 해동합니다. Ringer's P/S를 10-100 μg/mL의 FN 농도로 희석합니다.
4. 우물이나 접시의 바닥을 덮을 수 있을 만큼 충분한 FN 용액을 피펫으로 만듭니다. 예를 들어, 24웰 플레이트의 웰당 100μL, 35mm 접시의 경우 500μL입니다.
5. 뚜껑을 교체하고 가습 인큐베이터(또는 증류수에 적신 종이 타월이 있는 덮개가 있는 트레이)에서 최소 1시간 동안 38°C(100°F)에서 FN 용액으로 접시나 접시를 배양합니다.

3. 신경 주름 해부

1. Ringer의 P/S 용액이 들어 있는 깨끗한 접시에 배아를 옮기고 집게로 여과지 프레임을 잡고 앞뒤로 부드럽게 흔들어 배아의 시야를 가리는 노른자를 제거하여 배아를 헹굽니다. Ringer의 P/S를 교환하거나 흐려지면 새 접시로 옮깁니다.
2. 배아 등쪽/뼈 쪽을 해부 현미경 아래에 놓습니다. 배아를 종이 프레임에 올려 팽팽하게 펴고 제자리에 고정한 상태로 유지한 후, 집게를 사용하여 바이텔린 막을 제거하여 신경 주름을 노출시킵니다.
   메모: 배아가 종이 프레임에서 떨어지면 접시에 평평하게 놓거나 해부를 위해 실가드 코팅 접시에 고정할 수 있습니다.
3. 스프링 가위나 날카로운 텅스텐 바늘을 사용하여 중뇌 신경 주름을 조심스럽게 절제합니다. 팽창하는 시낭(optic vesicles)에 꼬리 조직(caudal)과 능형체(rhombomere) 수축이 막 나타나기 시작하는 후뇌(hindbrain)에 꼬리 조직을 포함시킨다(심장 초승달 모양도 유용한 지표이다, 그림 1B, C). 오염을 최소화한 신경관과 비신경 외배엽(non-neural ectoderm)으로 신경 주름의 가장 등쪽 부분을 절제하도록 주의하십시오(그림 1C).
4. P20 피펫터 또는 욀키 Ringer's P/S로 헹궈낸 멸균 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 Ringer's P/S가 들어 있는 깨끗한 접시에 신경 주름을 옮깁니다(이렇게 하면 플라스틱이나 유리가 막혀 조직이 달라붙는 것을 방지할 수 있습니다). 수집된 접힌 부분을 얼음 위에 보관하고 추가 주름을 해부합니다.

4. 신경 주름 도금

1. 완전 배양 배지의 분취액을 해동합니다(섹션 1, 3단계). 페니실린 100U/mL와 스트렙토마이신 100μg/mL를 첨가하고 필터 멸균합니다. 다른 단계를 수행하는 동안 준비된 매체를 37-38°C로 유지하십시오.
2. 인큐베이터에서 배양 접시를 꺼냅니다(섹션 2, 5단계). 피펫터 또는 파스퇴르 피펫을 사용하여 커버슬립, 접시 또는 웰에서 FN 용액을 제거합니다. FN 코팅 기질을 Ringer's P/S로 헹군 후 접시 또는 웰에 적절한 양의 완전한 배양 배지를 추가합니다(24웰 플레이트의 웰의 경우 500μL, 35mm 접시 또는 6웰 플레이트의 경우 2mL).
   메모: 더 작은 부피로는 값비싼 시약을 보존할 수 있지만(예: 24웰 플레이트의 경우 200μL 정도) 증발을 방지할 수 있도록 접시를 충분히 가습해야 합니다.
3. p20 또는 p200 피펫터를 사용하여 먼저 피펫 팁을 yolky Ringer's P/S로 헹구어 플라스틱을 막고 조직이 달라붙는 것을 방지합니다. 그런 다음 분리된 신경 주름을 FN 코팅된 커버슬립으로 옮기고 가능한 한 적은 Ringer의 P/S를 전달하도록 주의하십시오. 접힌 부분을 FN 코팅된 커버슬립의 중앙을 향해 놓습니다.
   메모: 하나 또는 몇 개의 신경 주름은 19mm 웰의 12mm 커버슬립에 도금할 수 있으며, 35mm 플레이트에 최대 50개까지 도금할 수 있습니다.
4. 외식식물이 10-15분 동안 안정되도록 한 후, 도금된 신경 주름이 있는 배양 접시를 천천히 조심스럽게 운반하여 38°C(100°F)의 가습 챔버에 넣습니다. 이렇게 하면 우물에서 신경 주름의 이동을 최소화하여 분산된 상태를 유지하고 커버슬립에 부착되도록 합니다.
   메모: L15(DMEM이 아님)를 사용하는 경우, 축축한 종이 타월이 있는 덮개가 있는 트레이를 사용하여 난자 배양기에서 외식 배양 접시를 배양할 수도 있습니다.
5. 활성 이동 기간 동안 가습된 인큐베이터에서 신경 주름 배양을 배양합니다(총 약 16-20시간, 그림 2).

결과

그림 1. 병아리 등쪽 신경 주름 해부. Ringer의 P/S에서는 스프링 가위를 사용하여 신경 주름을 절제했습니다. (A) 배아 등쪽 모습, 그림의 위쪽을 향한 앞쪽. 신경 주름은 주변 조직보다 더 불투명하게 보입니다. 중뇌 신경 주름은 시신경엽(분홍색)의 뒤쪽에 있고 심장 초승달 앞쪽(노란색)에 있습니다. (B) 신경 주름이 제거된 후 배아의 등쪽 보기, 절제 경계를 보여줍니다. (C) 신경 주름이 제거된 배아의 측면 보기. 해부 기법은 배쪽 신경관을 제거하여 배쪽 및 비신경관 구조를 피합니다. (D) Ringer의 P/S에서 고립된 신경 주름. 스케일 바 = 300μm.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ZEN 3.0 SR 소프트웨어로 제어되는 LSM710 컨포칼 스캔 헤드가 장착된 AxioObserver	자이스		알파 Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 대물렌즈 사용
염화칼슘2	시그마-알드리치	C3306 (영문
챔버 접시 (유리 바닥, 단일 또는 분할)	매트텍; 세포 시각화	P35G-1.5-14-C (매트텍) X000NOJQGX(셀비스) X000NOK1OJ(셀비스)	단일 챔버 35mm 또는 4 챔버 35mm
커버 유리	캐롤라이나 생물학 공급 회사	633029, 633031, 633033, 633035, 633037	원, 0.13–0.17mm 두께, 12-25mm 직경으로 사용 가능
DMEM/F12	써모피셔 사이언티픽	11320033	L15 미디어의 대안
계란 부화기	운동가	1502
FBS(증권 시세	생명 기술	10437-028
피브로넥틴	피셔 사이언티픽	CB-40008A
여과지	왓맨		등급 3MM 크로마토그래피
겸자(무딘)	피셔 사이언티픽; 토마스 사이언티픽	08-890 (어부); 1141W97 (토마스)
겸자(굵기)	정밀 과학 도구	11252-20	뒤몽 #5
핀 홀더	정밀 과학 도구	26016-12	텅스텐 바늘 (봄 가위 대체품)
케이클	시그마-알드리치	P3911
KH2사서함4	시그마-알드리치	P0662
L15 미디어	인비트로젠	11415064
L-글루타민	인비트로젠	25030
나2HPO4	시그마-알드리치	S9638
염화나트륨	시그마-알드리치	S9888
페니실린/스트렙토마이신	생명 기술	제15140-148	10,000 units/mL 페니실린; 10,000 mg/mL 스트렙토마이신
페트리 접시	VWR (또는 이와 유사한)		60mm, 100mm
가위(해부)	정밀 과학 도구	14061-10
봄 가위	정밀 과학 도구	15000-08	2.5mm 절삭날(텅스텐 바늘 대체)
실가드	크레이든	실가드 184
주사기 필터	시그마-알드리치	SLGVM33RS	Millex-GV 실린지 필터 유닛, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, 감마 멸균
조직 배양 접시	사르슈테트	83-3900	벌크 신경 폴드 배양을 위한 35mm 배양 접시
텅스텐 와이어	다양한 출처		텅스텐 바늘의 경우 0.01 "직경 (스프링 가위의 대체품)

) 년 표시기 년 년 년 (영문) (영문) 년 호 년 년 년