전정신경절 뉴런(Vestibular Ganglion Neurons from a Mouse Inner Ear)

초록

출처: Iyer, M. R. et al., Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings.J. Vis. 특급 (2023).

이 비디오는 새끼 쥐의 내이에서 전정 뉴런을 분리하는 방법을 보여줍니다. 이 책은 내이를 해부하고, 전정 신경절을 적출하고, 이어서 신경절을 단일 세포로 해리하는 단계를 꼼꼼하게 설명합니다. 그런 다음 이 세포를 유리 바닥 접시에서 배양하여 전정 뉴런 배양을 확립합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 준비

사항

참고: 이 섹션에 설명된 솔루션과 도구는 미리 만들 수 있으며 해부 및 기록 당일에 사용할 수 있습니다.

1. 10mM HEPES(L-15 용액)가 보충된 Liebovitz 배지를 준비합니다. 다음 단계는 1L의 L-15 용액을 만드는 방법을 설명합니다.
   1. 990mL의 탈이온화된 H₂O를 하나의 비커에 붓습니다. 2.386g(10mM)의 HEPES를 측정하고 추가합니다. L-15 용액 분말 1L 한 병을 추가합니다.
      알림: 분말 L-15는 유통 기한이 더 길고 보관 공간을 덜 차지합니다. 또는 L-15 용액을 구입하고 HEPES를 보충하십시오. 후자의 옵션에는 형광 이미징에 유용한 페놀이 없는 솔루션을 사용하는 옵션도 있습니다.
   2. 교반 플레이트에 용액을 저어줍니다. pH 측정기를 사용하여 1N 수산화나트륨(NaOH)을 천천히 첨가하여 7.34에서 7.36 사이의 pH를 얻습니다.
   3. 용액이 1,000mL의 부피에 도달 할 때까지 탈 이온화 된 H₂O를 첨가하십시오. 0.22μm 공극 크기의 멤브레인을 사용하여 용액을 여과합니다.
      메모: L-15 용액은 4 °C에서 1-2 주 동안 보관할 수 있습니다. 페놀 레드로 만든 L-15를 사용하는 경우 용액이 너무 염기성 (pH > 7.4) 또는 너무 산성 (pH < 7.34)이면 주황색으로 변합니다.
2. 전정신경절 뉴런(VGN)을 위한 배양 배지를 준비합니다. 아래 단계에 따라 50mL의 배양 배지를 만드십시오.
   1. 깨끗한 유리 비커에 GluMAX-I 최소 필수 배지 47.5mL를 추가합니다.
   2. 0.1194g(10mM)의 HEPES를 측정하고 추가합니다. 이 추가 버퍼는 세포가 인큐베이터로 이동하기 전에 가라앉는 동안 pH 변화에 저항합니다.
   3. 소 태아 혈청(FBS) 2.5mL를 추가합니다. 이는 총 50mL의 배지 부피에서 5% 부피의 FBS를 만듭니다.
   4. 교반 플레이트에 용액을 저어줍니다. pH 측정기를 사용하여 1N NaOH를 천천히 첨가하여 7.38에서 7.4 사이의 pH를 얻습니다.
   5. 페니실린-스트렙토마이신 0.5mL를 추가합니다. 0.22μm 멸균 필터를 통해 용액을 여과합니다. 용액을 4°C에서 보관하십시오.
   6. 사용하기 최소 30분 전에 배양 배지를 통풍 캡이 있는 조직 배양 플라스크로 옮깁니다. 배양 배지가 든 플라스크를 37°C에서 5% CO₂ 농도의 인큐베이터에 넣습니다.

2. 트리튜레이션 파이펫 제작

참고: Trituration 피펫은 여러 실험에 재사용할 수 있습니다. 매번 사용하기 전에 피펫을 에탄올, 물 및 L-15 용액으로 세척하고 사용 후에는 물과 에탄올로 세척하십시오. 사용 사이에 조심스럽게 보관하십시오.

1. 세포 해리를 위한 trituration 피펫을 준비하려면 유리 파스퇴르 피펫을 Bunsen 버너의 불꽃에 갖다 댑니다. 유리 팁이 녹기 시작하면 원하는 팁 직경까지 유리를 늘립니다. 피펫의 한쪽 끝을 화염에서 당겨 약간 구부립니다.
2. 구부러진 피펫을 현미경 가까이 가져갑니다. 점수 매기기 타일을 사용하여 점수를 매기고 원하는 직경으로 유리를 깨뜨립니다.
3. 피펫의 끝을 Bunsen 버너 화염 위에 통과시킵니다. 이렇게 하면 팁 근처의 거친 가장자리가 빠르게 연마됩니다. 팁이 화염에 밀봉되지 않았는지 확인하십시오.
4. 다양한 크기의 4개 또는 5개의 피펫이 준비될 때까지 이 과정을 반복합니다.

3. 전정신경절의 발치 및 전정뉴런의 도금

1. 해부 준비
   1. L-15 용액과 0.05% 콜라겐 분해 효소 및 0.25% 트립신의 효소 혼합물을 준비합니다. 예를 들어, L-15 용액 2mL에 콜라겐 분해 효소 0.001g과 트립신 0.005g을 비커에 넣고 작은 자석 교반기를 추가한 다음 완전히 섞일 때까지 저어줍니다. 실온에 보관하십시오.
   2. 단두대 측면과 아래에 종이 타월을 놓아 시중에서 구할 수 있는 단두대를 준비하여 벤치탑 및 기타 표면이 혈액 및 기타 생물학적 물질에 노출되는 것을 최소화합니다.
   3. 큰 스테인리스 스틸 가위, 큰 집게, 큰 스프링 가위를 놓습니다. 머리 청소를 위해 70% 에탄올이 함유된 큰 스프레이 병을 가까이에 두십시오.
   4. 100mL 비커에 L-15 용액을 채우고 얼음 위에 놓습니다. L-15 용액에 산소를 공급합니다.
   5. 스프링 가위, 수술용 가위, 집게, 메스 및 전사 피펫을 배치합니다(재료 표 참조).
   6. 60mm 페트리 접시(전체 해부용)와 35mm 페트리 접시 2개(신경절 세척/미세 해부용)를 준비합니다. 0.22μm 필터 팁이 있는 30mL 주사기를 사용하여 60mm 접시에 산소가 공급된 L-15 용액을 채웁니다.
2. 안락사, 머리 청소, 그리고 반쪽 절개
   1. 복강내로 투여하기 위한 치명적 희석액의 적절한 복용량을 계산하기 위해 새끼의 무게를 잰다(10g당 ~0.01mL).
   2. 깊은 마취 상태에 도달하면, 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족으로 평가되는 바와 같이, 단두대를 사용하여 목을 베십시오.
   3. 머리를 70% 에탄올로 철저히 헹군 다음 L-15 용액으로 완전히 헹굽니다.
   4. 두개골의 피부를 완전히 제거합니다. 척수가 뇌로 가는 입구에서 시작하여 큰 용수철 가위를 사용하여 머리를 양분하고 첫 번째는 두개골 상단을 절단하고 두 번째는 턱 하단을 절단하여 두 번 자릅니다. 수술 용 가위를 사용하여 머리를 이등분하는 것을 마칩니다.
   5. L-60 용액으로 채워진 15mm 페트리 접시에 머리 뇌의 양쪽 절반을 아래로 향하게 놓습니다. 현재 해부되지 않은 신선한 조직을 얼음 위에 놓습니다.
3. 상전정신경절(superior vestibular ganglion) 발치
   1. 닫힌 수술용 가위를 사용하여 뇌를 퍼냅니다. 두개골에서 뇌를 완전히 분리하기 위해 뇌신경을 절단하고 제거합니다.
      메모: 이 시점에서 귀낭(숫자 8 모양)이 머리 뒤쪽에서 보여야 합니다.
   2. 집게를 사용하여 머리 뒤쪽부터 시작하여 투명한 막 물질을 당겨 제거합니다.
   3. 수술용 가위를 사용하여 두개골 상단을 잘라냅니다. 머리와 목 뒤쪽의 과도한 조직을 제거하여 박리 부위와 이낭을 더 깨끗하고 쉽게 접근할 수 있도록 합니다.
      메모: 절차 전반에 걸쳐 과도한 조직을 버려 접시를 너무 흐리게 만들지 마십시오.
   4. 조직을 새 L-15 용액이 있는 두 번째 페트리 접시로 옮깁니다. 이낭(otic capsule)과 청각신경(auditory, superior vestibular), 하부 전정신경(superior vestibular nerves), 하전정신경(inferior vestibular nerves)을 찾습니다. 청각 신경을 잘라내고 작은 용수철 가위를 사용하여 상신경절과 하신경절을 분리합니다.
      메모: 전정신경의 소마타(somata)는 하신경절(thinder)과 상신경절(superior ganglia)에서 모두 발견되지만, 상신경절(superior ganglion)에서 추출한 세포가 더 잘 생존합니다.
   5. 메스를 사용하여 뼈 융기를 부드럽게 면도하여 신경이 뼈 캡슐로 다이빙하는 뼈 부위를 약화시킵니다. 미세한 집게로 조심스럽게 부스러기를 제거하여 신경절의 부풀어 오른 부분 전체를 노출시킵니다.
   6. 가는 용수철 가위를 사용하여 난소를 향해 다이빙하는 말초 신경 가지에서 신경절을 잘라 분리합니다.
   7. 미세한 집게를 사용하여 상신경절을 제거하되, 신경절 조직에 너무 가까이 끼지 않도록 주의한다. 신선한 L-35 용액이 있는 15mm 페트리 접시로 옮깁니다.
   8. 진행하기 전에 효소 용액을 예열하십시오 : 효소 혼합물을 35mm 페트리 접시에 붓고 37 ° C 인큐베이터에 10-15 분 동안 놓습니다.
   9. 가는 집게와 작은 스프링 가위를 사용하여 뼈(하얗고 결정화된 구조로 보임), 과도한 조직, 신경 섬유 및 기타 불필요한 구조를 제거하여 신경절을 청소합니다. 신경절 조직의 제거를 최소화하도록 주의하십시오.
4. 조직 해리 및 도금
   1. 세척된 신경절을 예열된 효소 용액에 옮기고 10-40분 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 조직이 분해되기 시작하면 효소 처리가 완료되지만 한 조각으로 남아 있습니다. 효소로 조직을 과도하게 처리하면 trituration.
      전에 신경절이 완전히 용해됩니다. 참고: 조직이 효소 처리를 받는 시간은 동물의 나이에 따라 다릅니다. 예를 들어, P9 쥐의 신경절은 25분 동안 효소로 처리되고, P15 쥐의 신경절은 35분 동안 효소로 처리됩니다.
   2. 새로운 L-15 용액을 사용하여 신경절을 35mm 페트리 접시로 옮기고 2-3분 동안 배양합니다.
   3. 신경절을 여과된 배양 배지로 채워진 다른 35mm 페트리 접시로 옮깁니다.
   4. 200 μL 마이크로피펫을 사용하여 여과된 배양 배지 ~150 μL 방울을 코팅된 유리 바닥 접시에 피펫으로 떨어뜨립니다. 유리 커버슬립 위에 남아 있는 용액 기포를 형성하기 위해 표면 장력을 유지하는 것이 중요하므로 용액을 너무 많이 추가하지 마십시오.
   5. 원하는 수의 신경절(1-4개)을 커버슬립으로 옮깁니다.
   6. 배양 접시에서 소량의 배양 배지를 추출하여 조직이 유리 피펫의 측면에 달라붙는 것을 방지하기 위해 배지로 트리추레이션 피펫을 헹굽니다. 신경절이 충분히 해리될 때까지 조직을 피펫을 통해 부드럽고 반복적으로 통과시켜 삼중화합니다.
      메모: 단일 세포 현탁액을 시도하기 위해 조직을 과도하게 작업하거나 과도한 양압을 사용하여 세포가 접시 바닥으로 충돌하도록 허용하지 마십시오. 또한 기포를 형성하면 세포 생존이 감소하므로 피하십시오. 부드러운 분쇄는 성공적인 세포 생존을 달성하는 열쇠입니다.
   7. 세포를 5분 동안 그대로 두십시오. 광학 현미경으로 세포가 커버슬립에 정착했는지 확인합니다.
   8. 배양 접시를 37 ° C 인큐베이터에 12-24 시간 동안 조심스럽게 놓습니다. 다시 말하지만, 용액의 거품을 그대로 유지하십시오.
      메모: 24시간 이상 배양하는 경우 매일 배양 배지를 새로 고칩니다. 이는 가능한 일시 중지 지점이 될 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
B27 보충제 (50개), 무세럼	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	17504044	배양 배지에 첨가제, SGN용
비커(1000, 100, 10) 밀리리터
벤치탑 원심분리기	미국 과학	제2641-0016
분젠 버너
콜라겐 분해 효소	시그마-알드리치	C5318	조직을 소화하는 효소 3개 중 1개
커버 유리, 직사각형, # 1 두께, 22x40	워너 인스트루먼트	우편번호 64-0707
디엠소	비오티움	90082
Dnase I,소 췌장에서	시그마-알드리치	11284932001	조직을 소화하는 효소 3개 중 1개
Dumont #3 집게(둔기)	정밀 과학 도구	11231-30
Dumont #5 집게(파인)	정밀 과학 도구	11251-10
Dumont #55 집게(파인)	정밀 과학 도구	11255-20
에탄올	디콘 랩스	2716	헤드 청소 및 해부 벤치 주변용
전극용 Filamented Borosilicate Capillaries	셔터 기기	BF140-117-10
미세한 해부 블레이드	정밀 과학 도구	10010-00
유리 파스퇴르 피펫	폭스바겐	제14673-010	Trituration 피펫을 당기려면
열 비활성화 소 태아 세럼	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	16140063	배양 배지에 첨가제
헤페스	시그마-알드리치	H3375-100지	프로토콜의 모든 용액을 pH 완충하기 위해
핫 플레이트/마그네틱 스티러	폭스바겐	76549-914
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대형 스프링 가위	정밀 과학 도구	14133-13
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배양 요리를 위한 Low-profile-bath 녹음 챔버	워너 인스트루먼트	Tel.: 64-0236
Luer-Lok 주사기, 30ml	BD (영어)	302832	L-15 / HEPES / HEPES 용액을 그리기 위해.
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N2 보충제 (100개)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제17502-048	SGN을 위한 배양 매체에 추가,
NaOH (1m)	토마스 사이언티픽	319511-500ML	적정 pH용
산소, 의료 등급, 적절한 레귤레이터 및 튜브 포함	USC 자재 관리	MEDOX200(식별자: 00015)	해부 및 수조 용액에 용해하기 위해
파라필름	베미스	미세먼지992
파스퇴르 피펫 전구 (3ml)	피셔 사이언티픽	03-448-25	Trituration 피펫용 전구
페니실린/스트렙토마이신	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	15140122	배양 배지의 오염을 방지하기 위한 첨가제
펜토바르비탈 기반 안락사 용액(예: Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg 투여)	MWI 동물 건강	15199	안락사를 위해
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PES 멤브레인 멸균 주사기 필터, 0.22um, 30mm	셀트리트	229747	주사기에 주입된 용액을 필터링하기 위해
페트리 접시, 35 x 10mm	제네시 사이언티픽	32-103	미세 해부 및 Tip dip 용액을 천공 패치 구성으로 고정하기 위해
페트리 접시, 60 x 15mm	미들랜드 사이언티픽	P7455	총체적 해부의 경우
pH 측정기	메틀러 톨레도	모델 S20
피펫터(1000, 200, 10) 마이크로리터	미국 과학
폴리 D 라이신 코팅 유리 바닥 문화 접시	마텍	P35GC-0-10-C	배양을 위해 뉴런을 플레이트화하기 위해
퀵 체인지 플랫폼, 가열식 베이스, 35mm 배양 접시용	워너 인스트루먼트	우편번호 64-0375
참조 셀	세계적인 정밀 기기	RC1T
메스 칼날	밀텍스	4-315
메스 손잡이	정밀 과학 도구	10003-12
과학적 규모	메틀러 톨레도	XS64
혈청학적 피펫 (10, 25) 밀리리터	피셔 사이언티픽
실리콘 그리스 키트(커버글라스 및 챔버 밀봉용)	워너 인스트루먼트	우편번호 64-0378
작은 동물 단두대	켄트 사이언티픽	DCAP
작은 동물 단두대	켄트 사이언티픽	DCAP	P15보다 나이가 많은 쥐를 해부하는 경우 참수용.
입체 음향 해부 현미경	자이스	스테미 2000
스트레이트 수술 용 가위	정밀 과학 도구	14060-09
주사기(3, 10, 30) 밀리리터
트립신	시그마 알드리치	T1426	조직을 소화하는 효소 3개 중 1개
투베르쿨린 주사기	코비디엔	8881500105	복강내 주사를 통한 안락사 용액 전달을 위해
Vannas 스프링 가위, 2.5mm 커팅 엣지	정밀 과학 도구	15000-08
부피 측정 플라스크, 1000 밀리리터
소용돌이	폭스바겐	945300
물, 멸균 u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm(예: Millipore-Sigma 정수 시스템으로 여과)	밀리포어-시그마	CDUFBI001

) 호 년 년 년 년 (영어) 년 호 ) 년 년 ) 호 ) 년 호 년 년 년 년