Isolating and Culturing Oligodendrocyte Precursor Cells from Mouse Pup Brain Cortex(쥐 강아지 뇌 피질에서 희소돌기아교세포 전구세포)

초록

출처: Sinyuk, M., et al. 여러 중추 신경계 영역에서 쥐 신경교의 해부 및 격리. J. Vis. 특급 (2020년)

이 비디오는 쥐 새끼 뇌 피질에서 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)를 분리하고 배양하는 기술을 보여줍니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 조직 해리

참고: 다음의 모든 절차는 무균 기술과 멸균 재료를 사용하여 생물 안전 캐비닛으로 지정된 멸균 조직 배양에서 수행됩니다.

1. 0.53mM EDTA를 함유한 0.05% 트립신 1mL를 9mL DMEM의 각 15mL 코니컬 튜브와 조직에 추가하여 조직 용해를 시작합니다.
   메모: DMEM에는 트립신 억제제로 작용할 수 있는 다량의 염화칼슘이 함유되어 있습니다. 설명된 단계에 따라 해리가 완료되지 않으면 칼슘이나 마그네슘이 없는 Hanks의 균형 잡힌 소금 용액을 사용할 수 있습니다. 트립신화 후 효소는 트립신 억제제를 첨가하여 중화할 수 있지만, 칼슘은 후속 단계에서 사용되는 DNase I의 보조인자이므로 용액에 다시 첨가해야 합니다.
2. 10mL 피펫으로 약 20배 분쇄합니다.
3. 세포 현탁액을 빈 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
4. 용액을 37 ° C, 5 % CO₂에서 15 분 동안 배양하고 8 분 후에 용해물을 부드럽게 교반합니다.
5. 각 튜브에 MGM 5mL와 200μL(5mg/mL) DNase I을 추가하여 최종 농도를 50μg/mL로 만듭니다.
6. 각 용해물을 10mL 피펫 10x로 분쇄합니다.
7. 세포 현탁액을 실온에서 3분 동안 그대로 두어 해리되지 않은 조직이 튜브 바닥에 정착할 수 있도록 합니다.
8. 세포 현탁액을 해리되지 않은 조직을 남기고 새로운 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
   메모: 위에서 설명한 lysis 및 trituration 단계는 비해리 조직의 양을 크게 제한합니다.
9. 브레이크 없이 300 x g에서 4°C에서 3분 동안 튜브를 원심분리합니다.
10. 상층액을 흡인하고 나머지 세포 펠릿을 MGM 5mL에 재현탁합니다.
11. 5mL 피펫 20x로 펠릿을 분쇄합니다.
12. 코팅된 T25 플라스크에 5mL 세포 현탁액을 플레이트링합니다.
13. 세포를 37 °C, 5 % CO₂에서 배양하고 24 시간 후에 배지를 초기에 변경하여 세포 파편을 제거합니다 .
    메모: 일부 프로토콜에서는 72시간 후에 초기 미디어 교체를 권장합니다. 이 단계를 최적화해야 할 수 있습니다.
14. 세포가 80% 융합될 때까지(약 5-7일) 48-72시간마다 MGM으로 100% 배지 교체를 수행합니다.
    알림: 모든 매체는 매체가 변경되기 전에 37°C로 예열되어야 합니다.

2. 희소돌기아교세포 전구체 세포 분리

초기 분리 후 OPC를 도금할 때는 폴리-D-라이신 코팅 표면(멸균 플레이트 또는 커버슬립)에 도금해야 합니다. 이 섹션을 완료하기 전에 이러한 자료를 준비합니다.

1. 15시간 동안 흔든 후 플라스크에서 상등액을 제거하고 멸균된 100mm 페트리 접시에 담습니다.
2. 상등액을 37 ° C, 5 % CO₂에서 30 분 동안 배양하고 15 분 후에 소용돌이 치면 남아있는 미세 아교 세포가 접시에 매우 빨리 부착되므로 제거됩니다. 이 단계에는 비조직 배양 처리된 페트리 접시를 사용할 수 있습니다.
3. 비부착성 세포 상층액을 제거하고, 계수를 세고, poly-D-lysine으로 코팅된 표면에서 플레이트합니다. 일반적으로 7,500-10,000 OPC는 도금/cm²입니다.
4. 37 ° C, 5 % CO₂에서 최소 1 시간 (최대 6 시간) 동안 배양 한 다음 매체의 95 %를 부드럽게 흡입하고 따뜻한 OPC 매체를 천천히 첨가하여 OPC의 중단을 최소화하기 위해 우물 벽에 배지를 피펫팅합니다. 셀을 사용할 준비가 될 때까지 48시간마다 배지를 교체하십시오.
   참고: 한 번에 하나의 우물만 변경하는 것이 중요합니다. OPC는 민감하며 특히 건조한 조건에 내성이 없습니다. OPC 배지에 PDGF-AA를 추가하는 것은 OPC가 희소돌기아교세포로 성숙하는 것을 지연시키는 것입니다. 이 인자는 실험의 초점이 성숙한 희소돌기아교세포인 경우 배양 배지에서 제외될 수 있습니다.

표 1: 버퍼 및 미디어 레시피.

혼합 글리아 미디어(MGM)

88 밀리리터	1X DMEM (고포도당, L-글루타민 포함, 피루브산 Na 포함)
10 밀리리터	열 비활성화 FBS
1.0 밀리리터	L-글루타민(100X)
1.0 밀리리터	항생제/항진균제

OPC 미디어(50mL)

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49 밀리리터	신경기저 배지
1.0 밀리리터	B27 보충제(50X)
10 ng / ml	PDGF-AA〈블랙
참고: PDGF-AA는 각 미디어 변경 전에 새로 추가됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.05% 트립신 및 0.53mM EDTA	지브코	25300054	조직 해리
pH 7.4 PBS 1개	지브코	10010031	표준 시약
50 mL, 25 cm 사각 세포 배양 플라스크	Greiner 바이오 원	690호 175	세포 배양(T25) 플라스크
항생제-항진균제 100X	지브코	제15240-096	미디어 구성 요소
B-27 보충제 50X	지브코	제17504-044	미디어 구성 요소
소 혈청 알부민	시그마	A9647-50G	항체 희석제
DMEM(1X), Na 피루브산이 함유된 고포도	지브코	11995040	미디어 구성 요소
드나세 I	시그마	10104159001	조직 해리
소 태아 혈청 열 비활성화	지브코	A3840001	미디어 구성 요소
행크스의 균형 잡힌 소금 용액 (Ca 또는 Mg 없음)	써모피셔	14170120	조직 해리
L-글루타민, 200mM	지브코	20530081	미디어 구성 요소
뉴로기저	지브코	제21103-049	미디어 구성 요소
노멀 염소 세럼	시그마	G9023	Blocking solution 구성 요소
Poly-D-Lysine 12mm #1 독일 유리 커버슬립	코닝 바이오코트	354086	세포 부착

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