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검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 조직 해리
참고: 다음의 모든 절차는 무균 기술과 멸균 재료를 사용하여 생물 안전 캐비닛으로 지정된 멸균 조직 배양에서 수행됩니다.
- 0.53mM EDTA를 함유한 0.05% 트립신 1mL를 9mL DMEM의 각 15mL 코니컬 튜브와 조직에 추가하여 조직 용해를 시작합니다.
메모: DMEM에는 트립신 억제제로 작용할 수 있는 다량의 염화칼슘이 함유되어 있습니다. 설명된 단계에 따라 해리가 완료되지 않으면 칼슘이나 마그네슘이 없는 Hanks의 균형 잡힌 소금 용액을 사용할 수 있습니다. 트립신화 후 효소는 트립신 억제제를 첨가하여 중화할 수 있지만, 칼슘은 후속 단계에서 사용되는 DNase I의 보조인자이므로 용액에 다시 첨가해야 합니다.
- 10mL 피펫으로 약 20배 분쇄합니다.
- 세포 현탁액을 빈 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
- 용액을 37 ° C, 5 % CO2에서 15 분 동안 배양하고 8 분 후에 용해물을 부드럽게 교반합니다.
- 각 튜브에 MGM 5mL와 200μL(5mg/mL) DNase I을 추가하여 최종 농도를 50μg/mL로 만듭니다.
- 각 용해물을 10mL 피펫 10x로 분쇄합니다.
- 세포 현탁액을 실온에서 3분 동안 그대로 두어 해리되지 않은 조직이 튜브 바닥에 정착할 수 있도록 합니다.
- 세포 현탁액을 해리되지 않은 조직을 남기고 새로운 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
메모: 위에서 설명한 lysis 및 trituration 단계는 비해리 조직의 양을 크게 제한합니다.
- 브레이크 없이 300 x g에서 4°C에서 3분 동안 튜브를 원심분리합니다.
- 상층액을 흡인하고 나머지 세포 펠릿을 MGM 5mL에 재현탁합니다.
- 5mL 피펫 20x로 펠릿을 분쇄합니다.
- 코팅된 T25 플라스크에 5mL 세포 현탁액을 플레이트링합니다.
- 세포를 37 °C, 5 % CO2에서 배양하고 24 시간 후에 배지를 초기에 변경하여 세포 파편을 제거합니다 .
메모: 일부 프로토콜에서는 72시간 후에 초기 미디어 교체를 권장합니다. 이 단계를 최적화해야 할 수 있습니다.
- 세포가 80% 융합될 때까지(약 5-7일) 48-72시간마다 MGM으로 100% 배지 교체를 수행합니다.
알림: 모든 매체는 매체가 변경되기 전에 37°C로 예열되어야 합니다.
2. 희소돌기아교세포 전구체 세포 분리
초기 분리 후 OPC를 도금할 때는 폴리-D-라이신 코팅 표면(멸균 플레이트 또는 커버슬립)에 도금해야 합니다. 이 섹션을 완료하기 전에 이러한 자료를 준비합니다.
- 15시간 동안 흔든 후 플라스크에서 상등액을 제거하고 멸균된 100mm 페트리 접시에 담습니다.
- 상등액을 37 ° C, 5 % CO2에서 30 분 동안 배양하고 15 분 후에 소용돌이 치면 남아있는 미세 아교 세포가 접시에 매우 빨리 부착되므로 제거됩니다. 이 단계에는 비조직 배양 처리된 페트리 접시를 사용할 수 있습니다.
- 비부착성 세포 상층액을 제거하고, 계수를 세고, poly-D-lysine으로 코팅된 표면에서 플레이트합니다. 일반적으로 7,500-10,000 OPC는 도금/cm2입니다.
- 37 ° C, 5 % CO2에서 최소 1 시간 (최대 6 시간) 동안 배양 한 다음 매체의 95 %를 부드럽게 흡입하고 따뜻한 OPC 매체를 천천히 첨가하여 OPC의 중단을 최소화하기 위해 우물 벽에 배지를 피펫팅합니다. 셀을 사용할 준비가 될 때까지 48시간마다 배지를 교체하십시오.
참고: 한 번에 하나의 우물만 변경하는 것이 중요합니다. OPC는 민감하며 특히 건조한 조건에 내성이 없습니다. OPC 배지에 PDGF-AA를 추가하는 것은 OPC가 희소돌기아교세포로 성숙하는 것을 지연시키는 것입니다. 이 인자는 실험의 초점이 성숙한 희소돌기아교세포인 경우 배양 배지에서 제외될 수 있습니다.
표 1: 버퍼 및 미디어 레시피.
혼합 글리아 미디어(MGM)
| 88 밀리리터 | 1X DMEM (고포도당, L-글루타민 포함, 피루브산 Na 포함) |
| 10 밀리리터 | 열 비활성화 FBS |
| 1.0 밀리리터 | L-글루타민(100X) |
| 1.0 밀리리터 | 항생제/항진균제 |
OPC 미디어(50mL)
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| 49 밀리리터 | 신경기저 배지 |
| 1.0 밀리리터 | B27 보충제(50X) |
| 10 ng / ml | PDGF-AA〈블랙 |
| 참고: PDGF-AA는 각 미디어 변경 전에 새로 추가됩니다. |