인간 배아 줄기 세포에서 뇌 오가노이드를 생성하는 기술

초록

출처: Boisvert, E. M., et al. 인간 배아 줄기 세포에서 뇌 오가노이드를 생성하기 위한 정적 자기 주도적 방법. J. Vis. 특급 (2020).

이 동영상은 인간 배아 줄기 세포(hESC)에서 대뇌 오가노이드를 생성하는 기술을 보여줍니다. hESC 집락의 부착 배양은 효소로 처리하여 분리하고 클러스터로 분해합니다. 이러한 클러스터는 현탁액으로 3차원 구체를 형성한 다음 뉴런과 신경교세포층이 있는 뇌 피질을 모방한 오가노이드로 분화하도록 유도됩니다.

프로토콜

1. 줄기세포 유지 관리

1. 제조업체의 지침에 따라 성장 인자 감소 기저막 매트릭스 층(재료 표 참조, 이하 간단히 매트릭스라고 함)에서 H9 hESC를 유지합니다.
   1. 6웰 플레이트 1개 또는 10cm 접시 1개를 코팅하려면 100μL의 매트릭스와 얼음처럼 차가운 Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM)/F12 배지 5.9mL를 결합합니다. 플레이트를 파라핀 필름으로 감싸고 4°C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 다음 날 여분의 매트릭스/배지를 흡인된 후 세포를 전달하기 위해 사용합니다.
2. 7일마다 약 1:12 분할 비율로 매주 세포를 배양합니다. 37°C의 저산소 인큐베이터(5% O₂, 5% CO₂)에서 mTESR-1 배지를 사용하여 세포를 유지합니다. 매일 미디어를 새로 고칩니다. 유리 도구를 사용하여 계대 간 배양에서 분화하는 세포를 제거합니다.
3. H9 세포는 오가노이드를 생산하는 데 사용하기 4-6일 전에 계대측정해야 합니다. 세포는 세포 클러스터의 약 1:8 비율로 계대형성되어야 합니다. 이를 위해 먼저 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지/영양 혼합물 F-12(DMEM/F12) 배지로 세포를 헹구고 중성 프로테아제(예: dispase, 이하 간단히 프로테아제라고 함)로 세포를 해리하고, DMEM/F-12로 헹구고, ~20% confluency에서 4개의 플레이트(6웰 또는 10cm)에 걸쳐 30-60개의 세포 클러스터로 플레이트합니다. 수확 이틀 전에 일반 인큐베이터(21% O₂, 5% CO₂)로 전환합니다. 플레이트는 오가노이드 형성을 시작할 때 ~80% 포화도에 도달해야 합니다.

2. 오가노이드 배양을 위한 hESC의 해리

1. 프로테아제 스톡 용액 분취량(5 U/mL).
   메모: 당사는 일반적으로 -20°C에서 1mL 분취액을 동결하여 수개월에 걸쳐 사용합니다.
2. hESC의 각 6-well 또는 10cm 플레이트에 대해 1mL의 원액과 5mL의 DMEM/F12를 추가하여 프로테아제 원액을 작업 농도로 희석합니다.
3. 세포 배양 배지를 흡인 및 제거한 다음 단백질 분해 효소 용액으로 hESC를 덮습니다. 플레이트를 인큐베이터에 10-15분 동안 또는 군집의 가장자리가 둥글게 되어 매트릭스에서 분리되기 시작할 때까지 놓습니다.
4. 플레이트를 기울이고 프로테아제 용액을 흡인하고 DMEM/F12로 세포를 세 번 부드럽게 세척합니다. 6웰 플레이트를 사용할 경우 세척할 때마다 2mL/웰을 사용하고 6cm 플레이트를 사용할 때 10mL를 사용합니다. 이 단계를 수행할 때 콜로니가 매트릭스에 부착된 상태로 유지되는지 확인합니다.
5. 약 1.5mL의 새로운 mTESR 배지를 각 웰에 다시 추가하고(10cm 플레이트의 경우 5mL) 부드러운 피펫팅을 사용하여 플레이트에서 세포를 씻어냅니다.
6. 10mL 피펫을 사용하여 hESC가 원래 크기의 약 1/30에 도달할 때까지 플레이트 내에서 hESC를 부드럽게 흡입하고 분주합니다. 이 단계가 완료되면 군집 클러스터는 ~250-350μm 크기의 정사각형과 유사해야 합니다.

3. 오가노이드의 생성

1. 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 없이 30mL의 mTESR 배지를 포함하는 단일 초저 부착 T75 플라스크로 세포를 전달합니다.
2. 다음 날, 라이브 셀이 모서리에 모이도록 플라스크를 기울입니다(첫날에는 5-10분이 소요될 수 있지만 클러스터가 커질수록 더 빨라집니다).
   메모: 이 단계 또는 후속 단계에서 플라스크 바닥에 부착된 세포가 많은 경우 세포를 새 플라스크로 옮깁니다. 처음 이틀 동안은 죽은 세포의 수가 많은 것은 정상입니다. 배지 교체를 수행할 때 가능한 한 많은 세포 파편을 제거해야 합니다.
3. 세포가 정착되면 배지와 죽은 세포를 흡인하여 살아있는 세포를 포함하는 약 10mL의 배지를 남깁니다.
4. ~20mL의 low bFGF 배지(1x N2, 1x B27, 1x L-글루타민, 1x 비필수 아미노산(NEAA), 0.05% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.1mM 모노티오글리세롤(MTG)에 30ng/mL bFGF가 보충됨)을 추가합니다.
5. 2일차에 셀을 확인합니다. 대부분의 세포가 건강하고 밝아 보이면 아무것도 할 필요가 없습니다. 그러나 세포의 1/3 이상이 어둡게 보이면 배지를 20ng/mL bFGF가 보충된 ~20mL의 낮은 bFGF 배지로 교체합니다(3.2단계와 동일한 틸팅 기법 사용).
6. 3일차에 배지의 절반을 (3.2단계의 틸팅 기법 사용) 10ng/mL bFGF가 보충된 20mL의 낮은 bFGF 배지로 교체합니다.
7. 5일차에 배지의 절반(3.2단계의 틸팅 기법 사용)을 20mL의 신경 유도 배지(NIM: DMEM/F12, 1x N2 supplement, 0.1mM MEM NEAA, 2μg/mL 헤파린)로 교체합니다.
   메모: 다른 세포보다 훨씬 큰 세포 또는 오가노이드의 큰 클러스터가 있는 경우 배양에서 제거해야 합니다. 크기는 현미경으로 보이는 것으로 추정됩니다. 예를 들어, 십자선이 있는 접안렌즈를 사용합니다. 대부분의 오가노이드는 비슷한 크기(약 100 ± 20μm)입니다. 다른 오가노이드보다 약 2배 작거나 큰 오가노이드를 제거했습니다.
8. 격일로 배지의 절반(~15mL)(틸팅 기법 사용)을 NIM으로 교체하십시오.
9. 배양 3주 후, 원하는 경우 100x 페니실린/스트렙토마이신을 배지(NIM: DMEM/F12, 1x N2 보충제, 0.1mM MEM NEAA, 2μg/mL 헤파린)에 첨가합니다. 격일로 미디어를 새로 고칩니다.
   메모: 이러한 방식으로 우리는 배양에서 최대 6개월 동안 오가노이드를 유지했습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
B27 보충제	Gibco, 미국 매사추세츠주 월섬	제17504-044
bFGF	Life Technologies, 미국 캘리포니아주 칼즈배드	PHG0263
증권 시세	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	A9647
디스플레이	STEMCELL Technologies, 캐나다 밴쿠버	7913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬	제11330-032
디피에스	Gibco, 미국 매사추세츠주 월섬	10010023
성장 인자 감소 마트리겔(매트릭스)	Corning, Corning, NY, 미국	356231
H9 헤에스코	WiCell, 미국 위스콘신주 매디슨	와09
덤플링을	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	9041-08-01
L-글루타민	Gibco, 미국 매사추세츠주 월섬	제25030-081
모노티오글리세롤	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	M6145
mTESR 미디어	STEMCELL Technologies, 캐나다 밴쿠버	85850
N2 뉴로플렉	Gemini Bio Products, 웨스트 새크라멘토, 캘리포니아, 미국	400-163
네아	Gibco, 미국 매사추세츠주 월섬	제11140-050
트리톤 X-100	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	T8787-100ML
초저 부착성 T75 플라스크	Corning, Corning, NY, 미국	3814

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