1. 복부 중뇌 및 척수 절제
참고: 형광 해부 실체현미경에서 1.1.1-1.1.3 및 1.1.5-1.1.6 단계를 제외한 다음 단계를 모두 수행합니다. 실험당 총 해부 시간은 일반적으로 3-5시간이며, 해부 기술의 숙련도와 각 실험에 필요한 운동 뉴런의 수에 따라 다릅니다.
- 복부 중뇌 박리술
- 임신한 쥐를 수정 후 약 11.5일 후에 이산화탄소 가스와 자궁경부 탈구로 안락사시킵니다.
- 복부에 에탄올을 철저히 뿌리고 멸균 마이크로 해부 가위와 엄지 드레싱 집게를 사용하여 자궁을 제거합니다. 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 자궁을 잠시 세척한 다음 미리 냉각된 멸균 PBS로 채워진 박리 플레이트로 옮깁니다.
- 현미경의 밝은 빛 아래에서 얼음처럼 차가운 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에서 멸균 마이크로 해부 가위, 엄지 드레싱 겸자 및 Dumont #5 핀셋을 사용하여 IslMN:GFP(Islet motor neuron: green fluorescent protein) 양성 배아를 자궁에서 조심스럽게 제거합니다. 멸균 Moria 미니 천공 스푼을 사용하여 각 배아를 1x B27이 보충된 미리 냉각된 Hibernate-E 저형광 배지로 채워진 24웰 플레이트의 별도 웰로 옮깁니다. 24웰 플레이트를 얼음 위에 보관하십시오.
- 배아 하나를 멸균 해부 플레이트에 이식하고 얼음처럼 차가운 멸균 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)으로 완전히 덮습니다.
- 해부 단계가 현미경의 FITC(fluorescein isothiocyanate) 조명 아래에서 수행되는지 확인합니다. 핀셋을 사용하여 중뇌를 손상시키지 않고 배아의 꼬리와 얼굴을 제거합니다(그림 1Ba). 배아를 엎드린 상태로 팔다리를 아래에 걸치고 꼬리가 현미경 앞쪽을 향하도록 하여 해부부를 향하게 합니다(별표로 표시, 그림 1Bb).
- 핀셋을 사용하여 네 번째 뇌실의 지붕을 잘라 작은 구멍을 만듭니다. 이 개구부를 사용하여 제4심실과 지붕 사이에 생성된 공간에 핀셋을 걸 수 있습니다. 배아의 등쪽 표면을 따라 피질로, 바닥판과 운동 기둥의 측면으로 절개합니다(그림 1Ca,b). 절개된 조직을 오픈북 방식으로 열어 GFP 양성 안구 운동 뉴런(뇌신경 3[CN3])과 트로클리어 뉴런(뇌신경 4[CN4]) 핵을 드러냅니다.
참고: 이제 중간엽, CN3 및 CN4를 포함하는 복부 중뇌의 작은 조직 조각이 노출됩니다.
- 배아에서 복부 중뇌를 조심스럽게 분리하고 핀셋과 마이크로 해부 칼을 사용하여 수막 조직을 제거합니다. 핀셋과 마이크로 해부 나이프를 사용하여 양측 GFP 양성 CN3 및 CN4 핵을 바닥 플레이트 및 기타 GFP 음성 주변 조직에서 멀리 해부합니다(그림 1D). 절제된 조직에서 GFP 양성 운동 뉴런의 수를 최대화하되 만지거나 손상시키지 마십시오.
- 별도의 CN3 및 CN4 핵 수집이 필요한 경우 이 두 핵의 정중선을 따라 절단합니다(그림 1D의 노란색 점선). P1000 피펫을 사용하여 HBSS를 최소화한 절개된 복부 중뇌 조직을 채취하여 박리 배지로 채워진 라벨이 부착된 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 해리될 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
- 총 수가 실험 요구 사항을 충족할 때까지 동일한 튜브에 있는 추가 배아의 복부 중뇌를 계속 풀링합니다(이상적인 세포 수는 4단계 참조).
참고: 약 1 x 104 CN3/CN4 운동 뉴런을 생성하는 최소 10개의 복부 중뇌의 풀링 컬렉션이 권장되는데, 이는 조직이 해리 및 분류 중에 스트레스를 받기 때문입니다.
- 복부 척수 박리
- 머리가 현미경 전면을 향하도록 배아를 엎드려 해부기 쪽으로 유지합니다. 한 쌍의 핀셋으로 배아를 잡고 다른 핀셋의 끝을 네 번째 뇌실의 열리지 않은 꼬리 부분에 삽입합니다.
- 배아의 전체 꼬리 범위에 걸쳐 뒷뇌와 척수의 나머지 부분을 등쪽으로 엽니다. 제4심실에서 시작하여 집게를 가위 삼아 꼬리 척수의 중심관을 향해 나아가는 등 조직을 절단하여 엽니다(그림 1Ca,b). 이 절차를 수행하는 동안 복부 척수를 만지거나 손상시키지 않도록 주의하십시오.
- 한 쌍의 핀셋으로 배아를 잡고 다른 핀셋으로 양쪽에 있는 등쪽 조직의 플랩을 집어 분리합니다(그림 1Ea,b).
참고: 절제된 등쪽 조직에는 등쪽 피부, 중간엽, 등쪽 뿌리 신경절(DRG), 등쪽 뒷뇌 및 척수가 포함됩니다. 척추 운동 뉴런(SMN) 핵은 접착력이 있어 여과 중에 SMN을 가두거나 형광 활성화 세포 분류(FACS) 중에 막힘을 유발할 수 있으므로 척추 운동 뉴런(SMN) 핵을 손상시키지 않고 가능한 한 많이 제거합니다.
- GFP 양성 SMN 바로 아래를 뚫기 위해 현미해부 칼을 사용하여 복부 척수를 제거합니다. 양쪽에서 톱과 같은 움직임으로 복부 척수를 들어 올립니다(그림 1Fa, b). 첫 번째 GFP 양성 전뿔이 돌출된 C1 바로 위에 떠 있는 복부 척수를 가로로 절단합니다(그림 1G). 또한 하지 상부에서 가로로 절단합니다(그림 1G). 이 절차 후에 복부 척수의 경추(C1)-요추(L2-L3) 부분을 제거합니다.
- 복부 척수 등쪽을 위로 향하게 놓고 핀셋 한 쌍으로 GFP 양성 SMN 컬럼 사이의 GFP 음성 조직을 눌러 유지합니다. 현미해부 나이프로 GFP 양성 SMN 컬럼의 양쪽을 트리밍하여 부착된 나머지 중간엽, DRG 및 등쪽 척수를 제거합니다(그림 1H). GFP 양성 운동 뉴런을 손상시키지 않고 최대화하도록 주의하십시오.
- P1000 피펫을 사용하여 최소 HBSS로 절개된 복부 척수 조직을 수집하고 박리 배지로 채워진 SMN 표지 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 해리될 때까지 얼음 위에 보관하십시오. 총 수가 실험 요구 사항을 충족할 때까지 동일한 튜브에 있는 추가 배아의 복부 척수를 계속 모읍니다.
메모: 약 2.1 x 104 SMN을 산출하는 최소 3개의 복부 척수를 수집하는 것이 권장되는데, 이는 조직이 해리 및 분류 중에 스트레스를 받기 때문입니다.
- 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 위해 각각 GFP 양성 및 GFP 음성 대조군으로 IslMN:GFP 마우스 배아의 안면 운동 뉴런과 사지를 수집합니다. SMN의 GFP 양성 축삭돌기가 이 배아 나이에 아직 사지로 확장되지 않았기 때문에 사지는 GFP 음성입니다.
2. 조직 해리
참고: 총 해리 시간은 일반적으로 실험당 1.5시간입니다.
- 파파인 및 알부민-오보뮤코이드 억제제 용액은 해리 30분 전에 37°C로 분취합니다.
- 저속으로 미세 절개 조직을 잠시 스핀 다운합니다.
- P100 피펫을 사용하여 조직을 흡인하지 않고 가능한 한 많은 Hibernate E를 조심스럽게 제거합니다.
참고: 다음 단계에서 파파인 해리의 효능이 감소하지 않도록 이 단계 후에 잔류 Hibernate E를 모두 제거해야 합니다.
- 미세해부된 조직 샘플이 들어 있는 1.7mL 미세원심분리 튜브 각각에 적절한 양의 파파인 용액(표 1)을 추가합니다.
참고: 세포에 가해지는 스트레스를 최소화하면서 효과적인 해리를 극대화하기 위해 해리를 위한 파파인의 적절한 부피를 결정했습니다.
- P200 파이펫으로 8배로 부드럽게 분쇄합니다. 운동 뉴런의 생존력을 보존하기 위해 모든 trituration 단계를 부드럽게 수행합니다.
- 조직이 들어있는 튜브를 37°C에서 30분 동안 배양하고 10분마다 10회씩 손가락으로 튕겨 교반합니다. 배양 후 P200 피펫으로 각 현탁액을 8회 부드럽게 분쇄합니다. 5분 동안 300 x g에서 셀을 스핀다운합니다.
- 다음 단계에서 오보뮤코이드 억제 효능을 보장하려면 P1000 피펫을 사용하여 조직을 흡인하지 않고 가능한 한 많은 상층액을 제거하고 폐기합니다.
- P200 피펫으로 8배를 부드럽게 분쇄하여 적절한 부피의 알부민-오보뮤코이드 억제제 용액(표 1)에 펠릿을 재현탁합니다.
- 해리되지 않은 조직의 나머지 조각이 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 2분 동안 기다립니다.
- P200 피펫을 사용하여 해리되지 않은 조직을 흡인하지 않고 가능한 한 많은 상층액을 수집합니다. 상층액을 새로운 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 2.10단계 후에도 일부 조직 덩어리가 해리되지 않은 상태로 남아 있는 경우, 원래 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브에 남아 있는 해리되지 않은 조직에 대해 2.8-2.10단계를 반복하여 2.10단계의 상등액에 포함된 이전에 해리된 세포에 가해지는 스트레스를 최소화하면서 해리된 세포의 최종 수율을 최대화합니다.
- 300 x g에서 5분 동안 세포를 스핀다운합니다. P1000 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 폐기합니다.
- P1000 피펫을 사용하여 8회 피펫팅하여 적절한 부피의 해부 매체(표 1)에 펠릿을 재현탁합니다. 세포 밀도가 107 cells/mL를 초과하지 않도록 최종 현탁액의 적절한 부피를 측정하여 유세포 분석 기계의 흐름을 차단할 수 있을 뿐만 아니라 세포가 과도하게 희석되어 분류 속도가 느려지지 않도록 했습니다.
- 70μm 세포 스트레이너를 통해 현탁액을 여과하여 큰 덩어리나 소화되지 않은 조직을 제거합니다. 현탁액을 5mL 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관에 옮기고 필요할 때까지 얼음 위에 보관합니다.
3. 형광 활성화 세포 분류(FACS)
참고: 이 프로토콜은 15mw 405nm 보라색 레이저, 100mw 488nm 청색 레이저, 75mw 594nm 주황색 레이저 및 40mw 640nm 적색 레이저가 장착된 FACS 분류기를 사용하여 최적화되었습니다. 세포는 100μm 노즐을 통해 무균 조건에서 멸균 PBS의 외피 유체로 분류되었습니다. 셀 응력을 최소화하기 위해 유속을 1-3의 샘플 압력으로 설정하여 초당 최대 1,000-4,000개의 이벤트를 획득했습니다. 총 FACS 시간은 일반적으로 실험당 1-2시간입니다.
- 세포 집단을 적절하게 시각화할 수 있도록 순방향 및 측면 산란에 대한 전압을 설정합니다. 세포 분류를 위한 적절한 전압을 설정하는 것은 복잡하며 숙련된 FACS 작업자가 필요합니다.
- 서로 다른 세포 집단을 구별하기 위해 전방 산란 영역(FSC-A)에 의해 결정된 크기와 측면 산란 영역(SSC-A)에 의해 결정된 내부 복잡성에 따라 셀을 플롯합니다. 그림 2Aa 및 그림 Ba에 표시된 대로 살아있는 세포 주위에 게이트를 그려 파편과 죽은 세포를 제외합니다. 게이트 영역 내의 세포를 모집단 1(P1)로 그룹화합니다.
- 세포 덩어리와 이중선을 제외하려면 SSC-A와 비교하여 SSC-W(Side Scatter Width)를 기반으로 P1 셀을 다음으로 플로팅합니다. 단일 세포의 모집단을 집단 2(P2)로 게이트합니다(그림 2Ab 및 그림 Bb).
- FSC-A 대비 전방 산란 폭(FSC-W)을 기반으로 P2 세포를 플로팅하고 단일 세포 모집단을 모집단 3(P3)으로 게이트합니다(그림 2Ac 및 그림 Bc).
메모: 3.3 및 3.4에서 두 개의 연속 게이트를 사용하면 세포 덩어리 및 이중선(높은 FSC-W 및 높은 FSC-A)이 제외됩니다.
- GFP 대 알로피코시아닌(APC)을 기반으로 하는 게이트 P3 세포. APC 채널은 자가형광을 감지합니다. 이 채널의 게이팅은 자가형광 세포의 포획을 방지합니다. GFP 음성 셀을 사용하여 FITC/GFP 형광 채널의 전압을 조정합니다. 이상적으로는 이러한 세포 집단에 대한 게이트를 약 102로 배치하는 것이 좋습니다. 각 유형의 운동 뉴런에 대해 개별적으로 GFP 양성 모집단 4(P4)에 대한 게이트 임계값을 선택합니다(그림 2Ad 및 그림 Bd).
참고: 순수 배양을 얻기 위해 CN3s/CN4s보다 SMN에 대해 GFP 게이트를 훨씬 더 높게 설정합니다(그림 2Ad 및 그림 Bd). SMN 배양에 대한 낮은 GFP 게이트는 신경교세포와 비운동 뉴런에 의한 배양물의 오염으로 이어집니다. 이는 누출된 프로모터로 인해 일부 신경교세포와 비운동 뉴런에서 낮은 수준의 GFP 발현이 있기 때문일 수 있습니다. 전체 세포와 비교한 GFP 양성 세포의 비율은 일반적으로 CN3s/CN4s의 경우 0.5-1.5%, SMN의 경우 1.5-2.5%입니다. 해부가 성공적이었다면 이 수치를 GFP 양성 게이트의 적절한 위치를 결정하기 위한 벤치마크로 사용할 수 있습니다(그림 2Ae 및 그림 Be).
- 제조업체의 프로토콜에 따라 FACS를 수행합니다. P4 세포를 500μL의 운동 뉴런 배양 배지로 채워진 새로운 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다. plating.
까지 얼음에 보관하십시오.
메모: 세포를 웰로 직접 분류할 수 있지만 이로 인해 웰당 세포 수가 고르지 않게 됩니다. 세포를 1.75mL 마이크로 원심분리 튜브로 분류한 다음 보다 균일한 도금 분포를 달성하기 위해 수동으로 도금합니다.
4. 정제된 일차 운동 뉴런의 배양
- 37°C로 예열된 모터 뉴런 배양 배지를 사용하여 각각 5 x 103 및 1 x 104 cells/mL의 밀도로 희석한 FACS-isolated CN3/CN4 및 SMN 현탁액을 희석합니다
메모: 하나의 E11.5 배아는 약 1 x 103 CN3/CN4 및 7 x 103 SMN을 산출합니다. 그러나 이러한 수율은 절개된 조직의 순도, 세포 해리의 철저성 및 FACS 중 GFP 게이트의 적절한 임계값에 크게 의존합니다.
- 37°C 조직 배양 인큐베이터에서 폴리D-라이신(PDL)과 라미닌이 사전 코팅된 96개의 웰 플레이트를 층류 후드로 옮기고 각 웰에서 라미닌을 흡입합니다. 접시와 커버슬립은 세탁하지 말고 즉시 사용하십시오.
- 200μL의 희석된 CN3/CN4 및 SMN 현탁액을 PDL/라미닌 코팅된 96 웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 최종 세포 밀도는 CN3/CN4 및 SMN에 대해 각각 1 x 103 및 2 x 103 cells/well이어야 합니다.
메모: 96웰 플레이트(2 x 10,3 셀/웰)에서 SMN의 초기 도금 밀도는 CN3s/CN4s(1 x 10,3 세포/웰)의 두 배이며, 이를 통해 시험관내(DIV) 2일 및 2일 및 9일(웰당 4-6 x 102 및 2-4 x 102 셀, 각기).
- 37 °C, 5 % CO2 인큐베이터에서 배양 뉴런
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- 5일마다 기존 배지(100μL)의 절반을 제거하고 동일한 부피의 새로운 운동 뉴런 배양 배지로 교체하여 뉴런을 공급합니다. 뉴런 프로세스가 1 DIV에서 표시되고 14 DIV만큼 두꺼워지고 길어지는지 확인합니다(그림 3). 신경 세포체는 비대해지고 장기 배양에서 응집되는 경향이 있으며, 특히 SMN의 경우 더욱 그렇습니다(그림 3).
참고: 배양된 세포가 분리되는 것을 방지하기 위해 원래 배지 부피의 절반을 남겨 두어 모든 배지 및 용액 변경을 수행합니다. 여기에는 고정 및 면역세포화학(ICC) 단계가 포함됩니다. 모든 매체를 제거하면, 아무리 부드럽게 제거해도 대부분의 세포가 분리되어 씻겨 나갑니다.
