Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from a Mouse Embryo(쥐 배아에서 눈동자, 트로클리어, 척추 운동 뉴런의 분리와 배양)

초록

Fujiki, R., et al. 태아기 Isl의 안구 운동, Trochlear 및 척추 운동 뉴런의 격리 및 배양 mn:GFP 형질전환 마우스. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오는 형질전환 마우스 배아에서 안구 운동, 대구 신경 및 척추 운동 뉴런을 분리하는 것을 보여줍니다. 배아는 쉽게 시각화하고 식별할 수 있도록 녹색 형광 단백질(GFP)로 표지된 운동 뉴런을 발현합니다. 운동 뉴런은 형광 현미경으로 외과적으로 분리되고 배양 배지에서 유지됩니다.

프로토콜

1. 복부 중뇌 및 척수 절제

참고: 형광 해부 실체현미경에서 1.1.1-1.1.3 및 1.1.5-1.1.6 단계를 제외한 다음 단계를 모두 수행합니다. 실험당 총 해부 시간은 일반적으로 3-5시간이며, 해부 기술의 숙련도와 각 실험에 필요한 운동 뉴런의 수에 따라 다릅니다.

1. 복부 중뇌 박리술
   1. 임신한 쥐를 수정 후 약 11.5일 후에 이산화탄소 가스와 자궁경부 탈구로 안락사시킵니다.
   2. 복부에 에탄올을 철저히 뿌리고 멸균 마이크로 해부 가위와 엄지 드레싱 집게를 사용하여 자궁을 제거합니다. 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 자궁을 잠시 세척한 다음 미리 냉각된 멸균 PBS로 채워진 박리 플레이트로 옮깁니다.
   3. 현미경의 밝은 빛 아래에서 얼음처럼 차가운 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에서 멸균 마이크로 해부 가위, 엄지 드레싱 겸자 및 Dumont #5 핀셋을 사용하여 Isl^MN:GFP(Islet motor neuron: green fluorescent protein) 양성 배아를 자궁에서 조심스럽게 제거합니다. 멸균 Moria 미니 천공 스푼을 사용하여 각 배아를 1x....

결과

표 1: 해리 단계에서 사용된 파파인, 알부민-오보뮤코이드 및 최종 현탁액의 적정 부피.다양한 수의 복부 중뇌 및 복부 척수 조직에 사용되는 적절한 양의 파파인 및 알부민-오보뮤코이드는 여러 차례의 최적화 후 제조업체의 지침에 따라 수정되었습니다. 조직은 해리와 분류 과정에서 스트레스를 받기 때문에 10개 이상의 복부 중뇌와 3개 이상의 복부 척수를 모으는 것이 좋습니다. 파파인의 부피는 효과적인 해리와 이 절차의 스트레스 사이의 균형을 고려하여 결정되었습니다. 알부민-오보뮤코이드 억제제 용액의 부피는 파파인의 절반입니다. Hibernate E 최종 현탁액의 적절한 부피는 세포 밀도가 10⁷ cells/mL를 초과하지 않도록 측정되었지만, 세포가 과도하게 희석되지 않도록 하였다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
B27 보충제 (50X), 무세럼	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제17504-044
BD FACSria llu SORP 유세포 분석기	BD 생명과학	-	여기에는 405, 488, 594 및 640nm 레이저가 장착된 4개의 레이저 시스템이 있습니다.
BD Falcon 70μm 나일론 셀 스트레이너	코 닝	352350	FACS 전에 해리 세포를 필터링합니다.
BD Falcon 스냅 캡이 있는 원형 바닥 시험관	코 닝	352054
BDNF 휴먼	ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. (프로스펙-타니 테크노진, Ltd.)	CYT-207
세포 배양 마이크로플레이트, 96 well, PS, F-bottom(굴뚝 웰)	Greiner Bio-One 인터내셔널	655090	우리는 여러 개의 96웰 요리를 시도했는데 이것은 ICC 이후 배양 및 분석에 가장 적합한 요리였습니다
CNTF 휴먼	ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. (프로스펙-타니 테크노진, Ltd.)	CYT-272
4",6-디아미디노-2-페닐리노돌(DAPI)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	D1306 (영어
디메틸 설폭사이드	시그마-알드리치	D2650	디엠소
Dumont #5 펜치 Inox 팁 크기 .05 x .01 mm Biologie 팁	Roboz 수술 기구	RS-5015
포스콜린	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	BP25205
GDNF 휴먼	ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. (프로스펙-타니 테크노진, Ltd.)	사이트-305
글루타맥스 보충제	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제35050-061
행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제14175-095
최대 절전 모드 E	브레인비츠	그
Hibernate E 낮은 형광	브레인비츠	헬프	배아의 GFP 발현 관찰을 방해하는 형광은 낮아야 합니다.
말 혈청, 불활성화, 뉴질랜드 원산지	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제26050-070
아이브엑스	토크리스 쿡슨	2845	이소부틸메틸크산틴
라미닌	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	23017-015
라이보비츠의 L15 미디엄	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	11415064
2-메르캅토에탄올	시그마-알드리치	M6250
마이크로 해부 가위	Roboz 수술 기구	RS-5913
마이크로 나이프 4.75" 1.7 x 27mm 블레이드	Roboz 수술 기구	RS-6272
Moria 미니 퍼포레이티드 스푼	정밀 과학 도구	10370-19
올림푸스 1.7ml 마이크로튜브, 투명	제네시 사이언티픽	22-281	이 튜브는 맥락에서 "1.7mL 마이크로 원심분리기 튜브"라고 설명한 튜브입니다.
파파인 해리 시스템	워딩턴 생화학 공사	LK003150	파파인 용액과 alubumin-ovomucoid 억제제 용액이 이 키트에서 제조됩니다.
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/ml)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	15140-122
인산염 완충 식염수(PBS)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제10010-023
폴리 D-리신(PDL)	밀리포어시그마	A-003-E
DS-Ri1 카메라가 있는 SMZ18 및 SMZ1500 줌 실체 현미경	니콘	-	해부를 수행하고 절개된 배아와 조직의 이미지를 이러한 형광 현미경으로 캡처합니다.
Sylgard 170 블랙 실리콘 봉지재 - A + B 0.9 Kg 키트	다우코닝	1696157	우리는 이 키트를 사용하여 해부 요리를 만듭니다.
TC 처리 접시, 100 x 20 mm	제네시 사이언티픽	25-202	이 접시를 사용하여 해부 요리를 만들고 있습니다.
Thum 드레싱 집게 4.5" 톱니 모양 2.2mm 팁 너비	Roboz 수술 기구	RS-8100
Zeiss LSM 700 시리즈 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 및 Zen 소프트웨어	칼 자이스	-	배아의 컨포칼 이미지는 이러한 장비로 캡처되었습니다

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