세포 생산 시설에서 신경 줄기 세포 배양 처리

초록

출처: Stover, A. E., et al,. 기초 및 전임상 연구를 위해 밀폐된 세포 배양 시스템에서 인간 만능 및 신경 줄기 세포를 배양합니다. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 신경 줄기 세포의 성장 및 유지를 위해 세포 배양 워크스테이션에서 통제된 환경을 유지하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이러한 절차에는 챔버 조건 설정, 세척 프로토콜 및 매체 준비가 포함되므로 최대 멸균 및 재현성을 유지하고 기존 방법을 대체합니다.

프로토콜

1. 초기 설정

1. 가스 및 온도 농도 설정
   1. 소프트웨어를 사용하여 그래픽 인터페이스의 왼쪽 상단 모서리에 있는 "게스트" 탭을 클릭합니다. 지정된 사용자 이름과 비밀번호를 사용하여 시스템에 로그인합니다. 각 사용자에게 사용자 이름과 비밀번호가 있는지 확인합니다.
   2. 조정할 모듈을 클릭합니다(그림 1). 현재 설정을 표시하는 새 창에서 "설정값" 아래의 기존 O₂ 설정값 값을 클릭하고 이 모듈의 필요한 O₂ 농도 수준을 입력합니다. 이 모듈에서 만능 줄기세포를 성장시키거나 조작하는 경우 5% O₂를 입력하고, 신경 줄기세포를 성장시키거나 조작하는 경우 9% O₂를 입력합니다. 녹색 확인 표시를 클릭하여 설정점을 확인합니다.
      메모: 두 개의 모듈, 즉 층류 후드와 현미경 챔버는 가스 조절이 불가능합니다. 층류 후드의 가스 농도는 대기하는 반면, 공정 챔버의 가스 농도는 현미경 챔버의 가스 농도를 수동적으로 유지합니다.
   3. CO₂에 대해 이 단계를 반복합니다. O₂에 대해서만 조정되는 버퍼 챔버를 제외한 모든 모듈에 대해 5% CO₂의 설정값을 입력합니다.
   4. "process values"라고 표시된 현재 가스 농도를 모니터링하여 새로운 설정점에 도달했는지 확인합니다.
   5. 모든 모듈의 가스 설정점을 적절한 값으로 조정합니다. 서로 노출될 CO₂ 및 O₂ 수준의 챔버를 일치시킵니다. 예를 들어, 5% O₂에서 세포를 성장시키는 인큐베이터를 열기 전에 공정 챔버를 5% O₂로 조정합니다. 또한 이 시간 동안 공정 챔버에 항목을 추가하는 데 사용되는 모든 버퍼 챔버에서 5% O₂로 변경합니다.
   6. 가스 조정을 위해 동일한 화면을 사용하여 프로세스 챔버의 온도를 37°C로 설정합니다. 또한 공정 챔버 바닥 온도는 37°C로 설정해야 합니다.
   7. 각 인큐베이터 아래에 있는 인큐베이션 모듈 뱅크를 클릭합니다. 뱅크의 온도를 37 °C로 조정합니다.
2. 버퍼 챔버의 작동
   1. 작업 흐름의 지연을 방지하기 위해 처음에 주어진 작업(공급, 분할, 염색 등)에 필요한 모든 소모품을 수집합니다. 모든 재료에 70% 에탄올을 자유롭게 분사하고 층류 후드에서 건조시킵니다. 플라스크나 세포 플레이트에 스프레이를 뿌리지 말고 70% 에탄올로 적신 멸균 거즈 스펀지로 부드럽게 닦으십시오.
   2. 버퍼 챔버의 외부 및 내부 도어가 단단히 닫혀 있는지 확인하십시오. 그런 다음 외부 문을 열고 안에 물건을 넣으십시오.
   3. 외부 도어를 닫습니다. 소프트웨어 내에서 버퍼 모듈을 선택하고 dilution factor 탭을 클릭합니다. 로그 계수 상자에 하나를 입력합니다. start.
      를 클릭합니다. 참고: "희석 계수"는 버퍼 모듈의 대기가 배출되고 깨끗한 HEPA 여과 가스로 교체됨을 의미합니다.
   4. 그래픽 인터페이스에서 "희석 계수"의 깜박임이 멈추면 버퍼 챔버의 내부 도어를 열고 재료를 공정 챔버 내부로 가져옵니다.
      주의: 내부 도어와 외부 도어가 동시에 열리지 않도록 하며, 버퍼 챔버가 희석 계수를 거치지 않은 경우 내부 도어를 열지 마십시오.
   5. 먼저, 공정 챔버에서 항목을 제거하고 버퍼 챔버가 희석 계수를 거쳤는지 확인합니다. 그런 다음 내부 도어를 열고 제거할 항목을 내부에 넣고 내부 도어를 닫습니다. 그런 다음 바깥쪽 문을 열고 항목을 제거합니다.
      참고 : 외부 도어를 열기 전에 희석 계수를 실행해서는 안 됩니다.

2. 세포 소개 및 공급

1. 인큐베이터 설정
   1. 각 인큐베이터 바닥에 있는 물 팬에 페트리 접시 3개를 놓습니다. 이 접시에 팬을 직접 채우지 말고 멸균 물로 채우십시오. 이러한 접시의 수위는 인큐베이터의 상대 습도(RH) 설정점을 유지하는 데 중요하므로 유지하십시오.
   2. 그래픽 인터페이스에서 인큐베이터를 클릭합니다. 설정값 아래에서 기존 상대 습도(RH) 값을 클릭하고 85%를 입력합니다. 녹색 확인 표시를 클릭하여 이 값을 수락합니다.
2. 세포를 위한 세포 생산 시설의 준비
   1. 아직 조정하지 않은 경우, 버퍼 챔버, 공정 챔버 및 인큐베이터를 도입하는 셀의 유형에 필요한 가스 설정점으로 조정합니다.
   2. 멸균 거즈와 불연성 소독제로 공정 챔버의 표면을 청소합니다. 과아세트산 기반 소독제를 사용하지 마십시오. 폐쇄 된 시스템에서 강하고 잔존하는 증기는 포유류 세포에 독성이 있습니다. 대신 염화벤잘코늄 기반 제품을 사용하십시오.
   3. 소독을 계속하십시오. 장갑과 문 손잡이와 같이 자주 만지는 표면을 청소하십시오. 소독제는 철저하지만 드물게 사용하십시오., 공정 챔버의 과도한 액체는 습도, 응결 및 미생물 성장의 원인이 될 수 있습니다.
   4. 층류 후드와 버퍼 챔버의 표면을 70% 에탄올로 청소하고 건조시킵니다. 플라스크 또는 세포 플레이트(이 경우 PSC(만능 줄기 세포) 또는 NSC(신경 줄기 세포))를 후드에 놓고 에탄올을 적신 멸균 거즈 스폰지로 외부 표면을 간단히 닦습니다.
   5. 플라스크 또는 플레이트를 버퍼 챔버에 넣고 희석 계수를 실행합니다(단계 1.2.3).
   6. 희석 계수가 완료되면 즉시 플라스크 또는 플레이트를 적절한 인큐베이터로 옮깁니다. 인큐베이터가 공정 챔버 뒤쪽에 있으므로 셀 배치를 위해 선반을 공정 챔버로 당겨 빼냅니다. 공정 챔버의 공기는 인큐베이터의 공기에 비해 매우 건조하여 인큐베이터의 습도를 크게 잃을 수 있으므로 인큐베이터 도어를 불필요하게 열거나 장기간 열지 마십시오.
3. 세포 배양 공급
   1. 혈청학적 피펫, 전자 피펫터, 거즈 및 소독제와 같은 매체 구성 요소를 수집합니다. 또한 사용한 세포 배양 배지를 위한 폐기물 용기를 모으되 표백제로 채우지 마십시오. 섹션 1.2에 설명된 대로 완충 챔버를 통해 재료를 공정 챔버로 가져옵니다. 최적의 작업 공간을 확보할 수 있도록 자재를 배치합니다. 사용하지 않는 품목을 공정 챔버 중앙에 두지 마십시오.
   2. 매체가 시스템 내에 존재하는 CO₂ 및 O₂ 수준과 평형을 이룰 수 있도록 미디어 용기의 뚜껑을 약간 비운 상태로 두십시오. 일부 PSC 매체 제조업체는 37ºC에서 매체를 데우지 말라고 나타냅니다. 그렇다면 버퍼 챔버를 사용하여 매체를 평형화합니다. 매체가 20분 동안 평형을 이룰 때까지 기다립니다.
   3. 적절한 입체 피펫과 전자 피펫터를 사용하여 웰에서 오래된 매체를 제거합니다. PSC의 경우, 공급 과정에서 건조를 방지하기 위해 남아 있는 소량의 기존 배지를 제외한 모든 매체를 제거합니다. NSC의 경우 이전 매체의 절반을 제거합니다. 폐기물을 쓰레기통에 피펫으로 넣습니다.
   4. 사용한 피펫을 원래 포장지에 다시 넣고 공정 챔버 측면 또는 폐기물 제거를 위해 지정된 완충 챔버로 이동합니다. 새로운 멸균 혈청학 피펫을 사용하여 세포 배양 플레이트에 새로운 배지를 추가하고 플레이트를 지정된 incubator에 다시 넣습니다.
   5. 수유가 끝나면 거즈에 소독제를 뿌리고 공정 챔버의 바닥과 문 손잡이를 철저히 청소하십시오. 시스템에서 여러 세포주가 성장하고 있는 경우, 각 세포주에 공급하는 사이에 멸균을 수행합니다. 이는 교차 오염의 위험을 최소화하는 데 도움이 됩니다.
   6. 완료 시 버퍼 챔버 중 하나를 통해 폐기물 또는 기타 불필요한 품목을 제거하십시오.

3. 세포 배양 분할

1. PSC 또는 NSC의 효소 패시에이징
   1. 패싱에 필요한 모든 아이템을 모으세요. 여기에는 배지, 효소 또는 비효소 세포 해리 완충액(후자는 NSC 전용), DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline), 플레이트 또는 플라스크, 세포외 기질(ECM), 원뿔형 튜브 및 혈청학적 피펫이 포함됩니다. 버퍼 챔버를 사용하여 시스템으로 가져옵니다.
   2. 앞서 설명한 대로 ECM으로 새 플레이트 또는 플라스크를 코팅합니다 9,10. 마우스 육종 세포주에서 파생된 것과 같은 일부 ECM은 4°C에서 15°C 사이에서만 액체이므로 멸균된 콜드 블록 또는 젤 아이스팩을 사용하여 가열된 공정 챔버에서 작업하는 동안 ECM을 차갑게 유지하십시오.
   3. 배양액에서 사용한 매체를 피펫으로 분리하여 폐기물 용기에 폐기합니다.
   4. DPBS/웰 1ml를 사용하여 웰 또는 플라스크 표면을 헹구고 DPBS를 폐기합니다.
   5. 각 웰에 1 - 2 ml의 따뜻한 효소를 첨가하십시오. 매우 조밀 한 배양 만 2ml가 필요합니다.
   6. 즉시 배양 접시 또는 플라스크를 현미경 챔버로 옮기고 배양을 관찰합니다. 접시에서 개별 세포가 느슨해지기 시작하는 징후를 관찰하십시오. 다음 단계로 진행하기 전에 세포가 현탁액으로 떠오를 때까지 기다리지 마십시오.
   7. 셀을 주 공정 챔버로 되돌립니다. 5ml 혈청학 피펫을 사용하여 효소 1ml당 DPBS 4ml를 추가한 다음 위아래로 강제로 피펫을 사용하여 웰 표면에서 세포를 제거합니다. 다중벽 플레이트 내에서 여러 웰을 통과시키는 경우, 개별 웰에서 세포를 제거하기 전에 각 웰에 DPBS를 추가합니다.
   8. 효소와 PBS 세포 현탁액을 적절한 크기의 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
   9. 셀 생산 시설에서 원심분리기를 사용할 수 없는 경우 원뿔형 튜브를 단단히 밀봉하고 완충 챔버에 넣은 다음 도어를 밀봉하여 닫습니다.
   10. 층류 측의 버퍼 챔버에서 원뿔형 튜브를 제거하고 RT에서 5분 동안 100 x g로 셀을 회전시킵니다.
   11. 원뿔형 튜브에 70% 에탄올을 분사하고 완충 챔버와 희석 계수를 사용하여 공정 챔버로 가져옵니다.
   12. 상층액을 피펫으로 제거하고 2ml의 PSC 또는 NSC 배지에 세포를 재현탁합니다. PSC를 전달하지 않는 경우, 배지에 10μM 농도의 ROCK(Rho-associated protein kinase) 억제제를 포함시킵니다.
   13. 혈구계를 사용하여 세포를 세고 필요한 웰 또는 플레이트를 결정합니다. 5 x 10⁴ - 1 x 10⁵ cells/cm의 플레이트 PSC². NSC를 1:2 비율로 분할합니다.
       참고: NSC는 종종 뭉쳐서 혈구계에서 정확한 계수를 거부합니다.
   14. 세포의 동결 보존이 필요한 경우, 모든 공급품과 동결 매체가 준비되어 공정 챔버 내부에 배치되었는지 확인하십시오. DMSO(Dimethylsulfoxide)는 37ºC에서 세포에 매우 독성이 있으므로 빠르게 작동합니다. 이소프로판올 재킷 냉동 용기를 층류 후드의 RT로 유지합니다. 동결 보존 바이알이 채워지고 밀봉되면 즉시 버퍼 챔버를 통과시켜 공정 챔버에서 제거합니다.
2. PSC의 수동 패시에이징
   1. 앞에서 설명한 대로 culture를 전달해야 하는지 확인합니다. 그렇다면 세포 외 기질로 코팅된 새 플레이트나 플라스크를 준비하십시오. 그런 다음 매체를 완전히 변경합니다.
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   2. 연성 소독제를 아끼지 않고 적신 멸균 거즈로 현미경 챔버를 청소하십시오—너무 많으면 과도한 김서림이 발생할 수 있습니다. 장갑, 바닥 부분, 무대만 청소하세요. 개별 포장된 200 μl 또는 1,000 μl 피펫 팁을 여러 개 챔버로 가져옵니다.
   3. PSC 플레이트를 현미경 챔버로 가져와 뚜껑을 제거한 다음 갓 청소한 바닥에 앞면이 아래를 향하도록 놓습니다. 뚜껑을 위로 올려 두면 밑면이 기류와 잠재적인 오염에 직접 노출됩니다.
   4. 피펫 팁의 포장을 풀고 현미경을 사용하여 배양을 시각화하고 피펫 팁을 사용하여 형태가 좋은 콜로니를 분리합니다.
      참고 : 개별 사용자가 더 편안하다고 생각하는 경우 피펫 팁을 피펫에 부착할 수 있습니다.
   5. 플레이트의 뚜껑을 교체하고 플레이트를 공정 챔버로 다시 이동합니다.
   6. 새 플레이트에서 과도한 ECM을 피펫으로 제거하고 기존 플레이트(현탁액에 콜로니 조각 포함)의 매체를 새 플레이트로 옮깁니다. 오래된 접시에 여전히 수확할 준비가 되지 않은 식민지가 포함되어 있으면 그들에게도 먹이를 주십시오.

결과

그림 1. 셀 생산 시설을 위한 그래픽 인터페이스. (A) CPF의 그래픽 표현은 기본 화면이며 그림 3에 표시된 CAD 도면과 일치합니다. 버퍼 모듈 1을 마우스로 클릭하면 제어 화면(B)이 열리며, 여기서 O₂ 값은 처리 챔버와 일치하도록 설정됩니다. 마찬가지로, Process Chamber 또는 Incubator 1을 클릭하면 해당 제어 화면(각각 C 및 D)이 나타나며, 여기서 값을 적절하게 변경하거나 모니터링할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Xvivo 시스템	바이오스페릭스	맞춤 제작
Xvivo 소프트웨어	바이오스페릭스	버전 IO2.1.2.1
O2 매니폴드	아미코	P-M2H-C3-S-U-옥시
CO2 매니폴드	아미코	M2H-C3-D-U-CO2
N2 매니폴드	서부의 혁신가	CTM75-7-2-2-BM
O2 가스
CO2 가스
N2 가스
페트리 접시
물
멸균 거즈
70% 에탄올	증권 시세 표시기	BDH1164-4LP
벤잘코늄 염화물 기반 소독제
Dulbecco의 인산염 완충 식염수
Hank's 기반 세포 해리 버퍼	생명 기술	제13150-016
2mL 혈청학적 피펫	폭스바겐	89130-894
5mL 혈청학적 피펫	Olympus 플라스틱	12-102
10mL 혈청학적 피펫	Olympus 플라스틱	12-104
25mL 혈청학적 피펫	Olympus 플라스틱	12-106
50mL 혈청학 피펫	Olympus 플라스틱	12-107
6웰 플레이트	코 닝	353046
20uL 피펫 팁	에펜도르프	22491130
200uL 피펫 팁	에펜도르프	22491148
1000 피펫 팁	에펜도르프	22491156
DP21 카메라와 형광을 이용한 현미경	올림푸스 주식회사	CKX41
인산염 완충 나트륨	하이클론	9236
디메틸 설폭사이드	프로타이드	PP1130
장갑

호 호 년 년 호 의