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HPS1006 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC) 라인은 일본 MEXT/AMED의 National Bio-Resource Project를 통해 RIKEN BRC에서 제공했습니다.
1. hiPSC 분화를 내피전구세포(EPC)로 유도
- 세포외 기질(ECM) 코팅 플레이트 및 시약
- 매트릭스 겔 2.5mg을 50mL 원심분리 튜브에 분취하여 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관하여 기저막 매트릭스 코팅된 12웰 플레이트를 준비합니다. 냉장고(4°C)에 보관되어 있는 차가운 Dulbecco의 변형된 Eagle's 배지/영양 혼합물 F-12(DMEM/F12) 30mL를 튜브에 넣습니다. 겔이 해동될 때까지 피펫팅을 통해 부드럽게 혼합한 다음 12웰 플레이트의 각 웰에 용액 500μL를 추가합니다. 플레이트를 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에 최소 1시간 동안 놓습니다.
메모: 기저막 매트릭스 겔은 온도에 민감하며 부분 표본 및 플레이트 코팅에 대한 제조업체의 지침에 따라 취급해야 합니다. 세포외 기질 단백질의 농도는 배치마다 다를 수 있습니다. 정확성을 보장하기 위해 정확한 농도는 로트 번호를 사용하여 특정 배치에 대한 품질 인증서 시트에 참조되어야 합니다. 예를 들어, 정확한 농도가 10.0mg/mL인 경우 250μL의 겔을 사용하여 총 2.5mg을 사용합니다.
- ROCK 억제제를 10mM 농도로 멸균수에 용해시켜 rho-kinase(ROCK) 억제제 원액을 준비합니다(표 1). 원액을 100-200 μL 부피로 분취하고 -20 °C에서 보관하여 동결-해동 주기를 방지합니다.
- 50g의 L-아스코르브산을 멸균수 50mL에 용해시켜 L-아스코르브산 100mg/mL 원액을 만들고 -20°C에서 보관합니다(표 1). 6.25mL의 글루타민과 305μL의 L-아스코르브산 원액을 500mL의 고급 DMEM/F12에 첨가하여 LaSR 배지를 만듭니다(표 1). 2-8 °C에서 최대 2 주 동안 보관하십시오.
- CHIR99021 CHIR99021 희석되지 않은 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 10mM의 최종 농도로 용해시켜 용액을 준비합니다(표 1). 동결-해동 주기를 피하기 위해 용액을 100-200μL 부피로 분취하고 최대 1년 동안 -20°C에서 보관하십시오. 원액의 작업 부분 표본을 최대 1개월 동안 4°C에서 보관하십시오.
- DMEM/F12 450mL에 열 비활성화 소 태아 혈청 50mL를 첨가하여 DMEM/F12-10 배지를 준비합니다. 배지를 2-8°C에서 최대 1개월 동안 보관합니다(표 1).
- 33.3mL의 7.5% 소 혈청 알부민(BSA)을 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(PBS) 467mL에 첨가하여 플로우 버퍼-1을 준비합니다(표 1). 2-8 °C에서 최대 6 개월 동안 보관하십시오.
- EPC 분화를 위한 단일화된 hiPSC의 파스딩 및 확장(-3일차에서 -1일차)
- 6-well plate의 hiPSC colonies가 자발적인 분화를 보이지 않고 일반적으로 약 80%의 confluency(2.5-3.5 x 106 cells)의 적절한 밀도를 가질 때 분화를 시작합니다. 현미경으로 자발적으로 분화된 세포를 주의 깊게 모니터링하여 미분화 세포를 제거하기 위해 여러 계대가 필요한지 확인합니다. 세포 배양 배지 및 세포외 기질에 대한 정보는 아래 1.4.15단계에 제공된 참고 사항을 참조하십시오.
- 배지를 흡입하고 웰에 1mL의 해리 시약을 추가하고 37°C에서 5-7분 동안 배양합니다. 해리 시약 용액을 웰 표면에 두세 번 부드럽게 피펫팅하여 세포를 해리하고 단일화합니다.
- 분리된 세포를 4mL의 hiPSC 유지 배지가 들어 있는 15mL 튜브로 옮기고 세포를 철저히 재현탁합니다. 세포 계수를 위해 10μL 분취량을 예약합니다.
- 20-25°C에서 200 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 세포를 계수하고 기저 멤브레인 매트릭스로 코팅된 12웰 플레이트에서 적절한 hiPSC 밀도(75-400 x 10, 웰당3개)를 달성하는 데 필요한 부피를 계산합니다(단계 1.1.1).
- 웰에서 코팅 용액을 흡입하고 10μM ROCK 억제제가 포함된 hiPSC 배지 1mL를 각 웰에 추가합니다(1:1,000 희석). 원심분리 후 상층액을 흡입하고 펠릿을 1mL의 hiPSC 배지에서 해리합니다.
- 1.2.4단계에서 측정한 필요한 부피의 hiPSC를 12웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 2-4개의 12-well plate는 hiPSC 클론을 구별하기에 충분할 수 있습니다. 1.2.4단계를 참조하여 세포 파종에 필요한 플레이트의 수를 결정합니다.
- 플레이트를 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에 넣습니다. 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 밀어 세포를 고르게 분배한 다음 인큐베이터에서 좌우로 밀어 넣습니다.
- 다음 날(즉, -2일차)에 배지를 ROCK 억제제가 없는 2mL의 hiPSC 유지 배지로 교환합니다. 다음 날(-1일차)에 배지를 2mL의 새로운 hiPSC 유지 배지로 교환합니다.
- 글리코겐 합성효소 키나아제 3(GSK-3) 억제제 CHIR99021를 사용한 EPC 유도(0일차부터 5일차까지)
- 0일차에 각 웰의 hiPSC 유지 배지를 8μM CHIR99021을 함유한 2mL의 LaSR 배지로 교체합니다.
- 1일차에 배지를 흡인하고 8μM CHIR99021을 함유한 새로운 LaSR 배지 2mL를 추가합니다.
- 2일, 3일, 4일째에 배지를 CHIR99021이 부족한 2mL의 새로운 LaSR 배지로 교체합니다.
- CD31+ EPC 정제를 위한 자기 활성화 세포 분류(MACS)(5일차)
- 5일차에 배지를 흡입한 다음 37°C에서 6-8분 동안 배양하기 전에 각 웰에 1mL의 해리 시약을 추가합니다.
- 마이크로피펫으로 세포를 해리 및 단일화하고 40μm 세포 스트레이너를 통과시켜 10mL의 DMEM/F12-10 배지가 들어 있는 50mL 튜브로 현탁액을 여과합니다. 2개 이상의 12웰 플레이트에서 수집된 세포 현탁액을 최소 2개의 50mL 튜브로 필터링합니다.
- DMEM/F12-10 배지(최대 50mL)를 첨가하여 분해 반응을 중지합니다. 철저히 피펫팅하고 세포 계수를 위해 10μL를 예약합니다. 20-25 °C에서 200 x g에서 5 분 동안 원심 분리하여 세포를 펠렛화합니다.
- 상층액을 제거한 후 10mL의 DMEM/F12-10 배지를 추가하고 세포 현탁액을 새로운 15mL 튜브로 옮깁니다. 20-25 °C에서 200 x g에서 5 분 동안 원심 분리하여 세포를 펠렛화합니다.
- 상층액을 흡인하고 완충액 100μL당1.0 x 10 7 세포의 밀도로 flow buffer-1에 재현탁합니다.
- Fc 수용체(FcR) 차단 시약을 1:100의 비율로 첨가하고 5분 동안 배양한 후 1:200으로 희석된 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 표지 CD31 항체를 첨가합니다. 20-25 °C의 어둠 속에서 30 분 동안 현탁액을 배양하십시오.
- 10mL의 flow buffer-1을 추가하고 CD31+ 세포의 분획을 결정하기 위한 유세포 분석을 위해 10μL의 현탁액을 보존합니다(그림 1).
- 20-25 °C에서 5 분 동안 200 x g에서 원심 분리하여 세포를 펠렛화합니다. 그런 다음 상등액을 제거하고 flow buffer-1 용액 100μL당 1.0 x 107 세포의 밀도로 재현탁합니다. FITC 선택 칵테일(세포 현탁액 100μL당 5μL)을 추가합니다. 피펫팅으로 철저히 혼합하고 20-25 °C에서 15분 동안 어두운 곳에서 배양합니다.
- 세포 현탁액 100μL당 5μL의 자성 나노입자를 첨가하고 피펫을 잘 낳은 다음 20-25°C에서 10분 동안 암흑 속에서 배양합니다.
- 세포 현탁액을 5mL 유세포 분석 튜브로 옮기고 flow buffer-1을 추가하여 총 부피 2.5mL를 얻습니다. 유세포 분석 튜브를 자석에 5분 동안 놓습니다.
- 연속적인 동작으로 자석을 반전시키고 FITC-CD31 항체로 표지되지 않은 세포가 포함된 세포 현탁액을 디캔팅합니다. 자석과 튜브를 2-3초 동안 거꾸로 유지한 다음 남은 액체를 제거합니다. 튜브를 수직 위치로 되돌리기 전에 튜브 가장자리에 있는 물방울을 흡입하십시오.
- 자석에서 유세포 분석 튜브를 집어 들고 flow buffer-1 2.5mL를 추가하여 나머지 CD31+ 세포를 세척합니다. 세포를 두세 번 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 세포를 재현탁합니다. 플로우 튜브를 자석에 5분 동안 놓습니다.
- 1.4.11-1.4.12단계를 세 번 반복한 다음 1.4.11단계를 한 번 더 반복하여 총 4회 세탁합니다.
- 자석에서 플로우 튜브를 제거하고 표시된 양의 적절한 배지(예: 확장된 EC 배양을 위한 human endothelial serum-free medium[hECSR] 또는 동결을 위한 동결 medium)를 튜브에 추가하여 정제된 CD31+ 세포를 재현탁합니다. 현탁액의 10 μL 분취액 2개를 예약하는데, 하나는 세포 계수용이고 다른 하나는 MACS 이후 샘플에서 CD31+ 세포의 순도를 평가하기 위한 유세포 분석 분석을 수행하기 위한 것입니다(그림 1). 유세포 분석기를 즉시 사용할 수 없는 경우 분석할 때까지 부분 표본을 4°C에서 보관하십시오.
- 이 시점에서 CD31+ EPC를 동결합니다.
메모: 기저막 매트릭스 코팅 플레이트와 hiPSC 유지 배지(mTeSR1) 대신 비트로넥틴으로 코팅된 12웰 플레이트와 보다 안정적인 hiPSC 유지 배지(mTeSR plus)를 사용할 수 있습니다. 비트로넥틴으로 코팅된 12웰 플레이트를 준비하려면 비트로넥틴을 희석 완충액으로 최종 농도 10μg/mL로 희석한 다음 희석된 용액 500μL를 12웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 플레이트를 최소 20시간 동안 25-1°C로 두십시오. 단일화된 hiPSC의 파딩 밀도는 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 사용되는 것과 비슷합니다. 배양 배지 또는 기질 조성을 변경하면 hiPSC의 증식 및 자발적 분화에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 일반적으로 새로운 배양 조건에 적응하는 데 1-2주가 소요됩니다. 보다 안정적인 hiPSC 유지 배지를 hiPSC 유지 매체에 사용하는 경우, 이 배지는 hiPSC 유지 배지 대신 EPC 감별에 사용할 수 있습니다. 이 경우, 보다 안정적인 hiPSC 유지 배지를 -2일째에 변경하여 ROCK 억제제를 제거해야 하며, -1일째의 교환은 건너뛸 수 있습니다.