Magnetic-Activated Cell Sorting을 이용한 CD31+ 내피 전구 세포의 정제

초록

출처: Matsuo, K., et al. 성숙한 면역 표현형을 가진 뇌 미세혈관 내피 세포 유사 세포로의 인간 유도 만능 줄기 세포의 분화. J. Vis. 특급 (2023).

이 동영상은 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 사용하여 배양액에서 CD31⁺ 내피 전구 세포(EPC)를 정제하는 기술을 보여줍니다. 세포 현탁액은 EPC의 CD31에 결합하는 형광단 접합 항체로 처리됩니다. CD31⁺ EPC의 라벨링을 완료하려면 형광단에 결합하는 항체 복합체와 항체 복합체에 결합하는 폴리머 코팅된 자성 나노입자를 추가해야 합니다. 그런 다음 표지된 세포는 자기장을 사용하여 정제되고 CD31^- 세포는 폐기됩니다.

프로토콜

HPS1006 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC) 라인은 일본 MEXT/AMED의 National Bio-Resource Project를 통해 RIKEN BRC에서 제공했습니다.

1. hiPSC 분화를 내피전구세포(EPC)로 유도

1. 세포외 기질(ECM) 코팅 플레이트 및 시약
   1. 매트릭스 겔 2.5mg을 50mL 원심분리 튜브에 분취하여 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관하여 기저막 매트릭스 코팅된 12웰 플레이트를 준비합니다. 냉장고(4°C)에 보관되어 있는 차가운 Dulbecco의 변형된 Eagle's 배지/영양 혼합물 F-12(DMEM/F12) 30mL를 튜브에 넣습니다. 겔이 해동될 때까지 피펫팅을 통해 부드럽게 혼합한 다음 12웰 플레이트의 각 웰에 용액 500μL를 추가합니다. 플레이트를 인큐베이터(37°C, 5% CO₂)에 최소 1시간 동안 놓습니다.
      메모: 기저막 매트릭스 겔은 온도에 민감하며 부분 표본 및 플레이트 코팅에 대한 제조업체의 지침에 따라 취급해야 합니다. 세포외 기질 단백질의 농도는 배치마다 다를 수 있습니다. 정확성을 보장하기 위해 정확한 농도....

결과

표 1: 분석을 위한 특정 시약의 세부 정보. 각 특정 시약에 대한 성분의 이름과 정확한 양이 설명되어 있습니다.

.......

특정 시약	성분	음량
아세트산, 0.5 mg/mL 용액	아세트산	119 마이크로L
	물, 멸균, 세포 배양	250 밀리리터
블로킹 버퍼	탈지유

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.22mm 실린지 필터	증권 시세	99722
15 mL 원심분리기 튜브	송골매	352196
40 μm Falcon 세포 여과기	송골매	352340
5 mL 라운드 튜브	증권 시세	40005
50 mL 원심분리기 튜브	송골매	352070
96웰 플레이트, 둥근 바닥	증권 시세	34096
아카쿠타아제	시그마-알드리치	A6964-500ml
아세트산	시그마-알드리치	695092
고급 DMEM/F12	생명 기술	12634
All-in-One 형광 현미경	키엔스	BZ-X810
B-27 보충제 (503), 무혈청	Thermo Fischer Scientific	17504044
소 혈청 알부민(BSA), dPBS 7.5%	시그마-알드리치	A8412
CellAdhere 희석 완충액	스템셀 테크놀로지스	세인트-07183
CHIR99021	Selleck 화학 물질	S1263 (영어
인간 태반에서 추출한 콜라겐 IV	시그마-알드리치	C5533
코닝 조직 배양 플레이트(12-well)	코 닝	3512
코닝 조직 배양 플레이트(6-well)	코 닝	3506
크라이오 튜브 이너캡 2.0 mL	왓슨	1396-201초
디메틸설폭사이드(DMSO), 멸균	시그마-알드리치	D2650
DMEM (13), [+] 4.5 g/L D-글루코오스, [-] L-글루타민, [-] 피루브산	Thermo Fischer Scientific	제31053-028
Dulbecco's (d) PBS (칼슘, 마그네슘 제외)	써모 피셔	14190250
둘베코의 변형 이글의 배지/영양 혼합물 F-12 (DMEM-F12)	Thermo Fischer Scientific	11320074
EasySepFITC 포지티브 선택 키트 II	스템셀 테크놀로지스	18558
EasySep마그넷	스템셀 기술	18000
에틸렌디아민테트라아세트산 용액DPBS 중 0.02%	시그마	E8008-100ML
소 태아 혈청, 인증	Thermo Fischer Scientific	10270106
HEPES 완충 용액	Thermo Fischer Scientific	제15630-056
인간 내피 혈청 프리 배지(hESFM)	Thermo Fischer Scientific	제11111-044
인간 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2)	토크리스	233-FB-500
iPS 인간 유도 만능 줄기 세포	리켄 RBC	HPS1006
카나마이신 설페이트(100x)	Thermo Fischer Scientific	제15160-047
L-아스코르브산, 2-인산염, 세스키마그네슘, 소금, 수화물	시그마-알드리치	A8960-5G
L-글루타민 200mM(1003)	Thermo Fischer Scientific	제25030-024
Matrigel, 성장 인자 감소	코 닝	제354230
멤 네아 (1003)	Thermo Fischer Scientific	제11140-035
ROCK 억제제 Y-27632	토크리스	1254
RPMI 미디엄 1640 트리스 베이스	시그마-알드리치	93362
트리톤 X-100	시그마-알드리치	엑스100