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검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 원료 배지 준비 및 줄기세포 회수
- 1.1.1.-1.1.5 단계에서 시약을 결합하여 배양 배지 스톡(DFHGPS)을 준비합니다.
- 고포도당과 L-글루타민(D)이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium 210mL를 추가합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
- Ham의 F12 영양 혼합물 70mL를 L-글루타민 보충제(F)와 함께 추가합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
- 4.2mL의 15mM HEPES 완충액(H)을 넣고 실온에서 보관합니다.
- 10% D-포도당 용액(G) 4.2mL를 넣고 실온에서 보관합니다.
- 페니실린/스트렙토마이신(PS) 용액 2.88mL를 추가합니다. 원액을 3mL 분취액으로 분취하고 필요할 때까지 -20°C에서 분취액을 보관합니다.
메모: 배지 내 페니실린의 최종 농도는 100 units/mL이고 스트렙토마이신의 농도는 100 μg/mL입니다. 이 배지는 프로토콜의 나머지 부분에 대해 DFHGPS라고 하며 1-2주 이내에 사용하기 위해 4°C에서 보관해야 합니다. 필요한 경우 DFHGPS를 비례적으로 확장할 수 있습니다.
- 세포를 회수하기 전날, HNSC 세포주의 이전 배양에서 얻은 5mL의 컨디셔닝 배지로 T75 플라스크를 코팅하고 8.5% 이산화탄소(CO2)가 함유된 37°C 인큐베이터에 밤새 그대로 둡니다.
메모: 현재 hNSC를 배양하고 있는 경우, 배지 변화 중에 세포가 자란 배지를 저장하십시오. 이것은 세포에 의해 "조건화"되었기 때문에 조건화된 배지입니다. 컨디셔닝된 배지는 스크류 캡 튜브에 보관하고 4°C에서 약 7일 동안 보관할 수 있습니다. hNSC를 받으려면 교신저자에게 연락한다. 조건화된 배지가 선호되지만 특히 hNSC의 배양을 처음 시작할 때 절대적으로 필요한 것은 아닙니다.
- 회복 당일, 50mL 스크류 캡 튜브에 20mL의 DFHGPS를 37°C 수조에서 최소 10분 동안 데우고 사용할 준비가 될 때까지 수조에 보관합니다.
- 별도의 15mL 나사 캡 튜브에 10mL의 DFHGPS를 37°C 수조에서 최소 10분 동안 데우고 1.13단계에서 사용할 준비가 될 때까지 수조에 보관합니다.
- 얼음 용기와 모든 중간 구성 요소를 회수합니다(표 1). 얼음 위의 모든 중간 구성 요소를 해동하고 중간 크기 변경을 준비하는 동안 얼음 위에 그대로 두십시오.
- 컨디셔닝된 배지 스톡 5mL(4°C에서 보관)를 구하고 1.14단계에서 사용할 준비가 될 때까지 37°C 수조에 보관합니다. 1.2단계 이후의 주석은 조건화된 배지 또는 현재 인간 태아 신경 줄기 세포 배양이 없는 경우 참조하십시오.
- 1.3단계에서 50mL 나사 캡 튜브를 꺼내 생물 안전 작업대(BSC)에 넣습니다. 10mL의 DFHGPS를 새 15mL 나사 캡 튜브에 옮긴 다음 나머지 50mL의 DFHGPS 매체가 들어 있는 10mL 튜브를 37°C 수조에 다시 놓습니다.
- 액체 질소에 저장된 hNSC의 cryo-vial을 얻습니다. 현재 인간 태아 신경 줄기 세포 배양이 없는 경우 1.2단계 이후의 참고 사항을 참조하십시오.
메모: 인간 신경 줄기세포는 원래 버려진 인간 태아의 뇌에서 유래했으며12 유전자 변형 없이 배양에서 유지되었습니다10. 5 × 106 셀은 T75 플라스크에서 해동하고 도금해야 합니다. 각 cryo-vial에는 5 × 106 개의 세포가 포함되어야합니다. 따라서 플라스크당 하나의 바이알이 필요합니다.
- 37°C 수조에서 약 10분 동안 또는 얼음이 녹고 바이알의 내용물이 완전히 액체가 될 때까지 바이알을 뒤집어 세포 바이알을 해동합니다. 잠재적인 오염을 방지하기 위해 바이알 전체를 물에 담그지 마십시오.
- BSC에서 P1000 마이크로 피펫을 사용하여 해동된 세포 용액을 흡인하고 10mL의 DFHGPS가 포함된 1.7단계의 15mL 튜브에 적가합니다. 해동된 세포 용액을 떨어뜨려 추가하려면 플런저를 천천히 눌러 한 번에 한두 방울만 방출되도록 합니다. 한편, 15mL 튜브를 휘젓고 빠르게 혼합할 수 있습니다.
- 실온에서 200 x g의 세포 현탁액을 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리고 세포 펠릿을 유지하십시오.
- 1.11단계에서 1.7단계의 나머지 10mL가 들어 있는 50mL 튜브를 회수합니다. 원심분리 후 세포 펠릿을 10mL DFHGPS에 재현탁하고 실온에서 5분 동안 200 x g에서 다시 원심분리합니다.
- 최종 스핀 중에 BSC의 1.4단계(표 1)에서 10mL의 DFHGPS 배지에 성장 인자를 추가하기 위해 표 1에 따라 새로운 성장 배지를 준비합니다. 사용할 준비가 될 때까지 BSC에 성장 인자를 포함하는 새 배지를 그대로 둡니다.
- 1.2단계에서 T75 플라스크를 회수하고 흡인으로 플라스크를 코팅하는 컨디셔닝된 매체를 폐기합니다. 그런 다음 1.6단계에서 컨디셔닝된 배지 5mL를 추가합니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 플라스크에. 플라스크 바닥이 긁히지 않도록 주의하세요.
- 원심분리기에서 세포 튜브를 회수하고 세포 펠릿을 그대로 두고 흡입하여 상층액을 버립니다.
- 5mL 혈청학적 피펫을 사용하고 위아래로 여러 번 피펫팅하여 1.13단계의 새로운 배지 10mL에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 1.14단계에서 코팅된 T75 플라스크에 현탁액을 추가합니다. 나머지 5mL를 사용하여 세포 펠릿이 들어 있는 튜브를 헹구고 해당 5mL도 플라스크에 추가합니다.
- T75 플라스크를 앞뒤로 3번 흔들어 세포가 플라스크 전체에 고르게 분포되도록 합니다. 공기 흐름이 가능하도록 플라스크의 캡이 느슨한지 확인하십시오. 광학 현미경으로 세포를 관찰하고, 기록하고, 가능하면 이미지를 촬영합니다.
메모: 세포는 반투명하고 구형으로 보여야 합니다. 어둡거나 불투명하거나 비대칭 경계가 있는 세포가 있는 경우 세포가 죽었음을 나타낼 수 있으므로 기록해 두십시오. 또한 미디어가 노란색으로 변하는 것과 같은 곰팡이 또는 박테리아 오염에 주의하십시오.
- 세포 플라스크를 8.5% CO2.
의 37°C 인큐베이터에 넣습니다.
메모: 이 무혈청 배양 배지의 pH를 7.1-7.4 범위로 유지하려면 5.0% CO2 대신 8.5%를 사용하십시오.
2. hNSC 매체 변경
참고: 3-4일마다 매체를 변경하십시오.
- BSC를 켜고 70% 에탄올로 철저히 청소하십시오. 광학 현미경으로 세포를 관찰합니다.
메모: 셀의 모양과 구 크기를 기록해 둡니다. 회복 또는 통과 후 3일 후, 세포는 함께 뭉쳐서 비부착성 신경구를 형성하기 시작합니다.
주의: 세포가 플라스크 바닥에 부착되면 세포 부착으로 인해 조기 분화가 증가하고 세포가 줄기 상태를 유지할 수 없으므로 배양물을 폐기해야 합니다. 플라스크에 세포가 너무 많으면 세포가 큰 구체(직경 2mm 이상)를 형성할 수 있으며, 이 경우 배지의 성장 인자에 대한 접근 부족으로 인해 구 중앙에 있는 세포가 분화하기 시작합니다. 직경이 1mm보다 큰 구체가 관찰되면 세포를 계대화할 수 있습니다(단계 3.1-3.22).
- 1.4단계 및 1.5단계를 수행하고 10mL의 새 배지를 준비합니다(1.13단계 참조).
- 플라스크를 옆으로 기울여 구체가 플라스크 바닥으로 가라앉도록 합니다.
- 신경구를 흡인하지 않도록 주의하면서 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 풀링된 배지 상단에서 5mL의 컨디셔닝된 배지를 제거합니다. 컨디셔닝된 5mL의 배지를 깨끗한 15mL 튜브에 넣습니다.
- 플라스크에서 컨디셔닝된 매체 5mL를 추가로 제거하고, 다시 구를 조심스럽게 피한 다음 5mL를 동일한 15mL 튜브에 넣습니다.
- 2.2단계의 새 배지 10mL를 플라스크의 나머지 5mL의 컨디셔닝 배지 및 세포에 추가합니다. 플라스크를 평평하게 놓고 광학 현미경으로 세포를 관찰합니다.
- 컨디셔닝된 배지를 채취하는 동안 세포가 흡인된 것으로 보이면 컨디셔닝된 배지를 실온에서 5분 동안 100 x g로 회전시킵니다. 컨디셔닝된 배지 1mL의 바닥에 축적된 모든 세포를 다시 현탁시킨 다음 배양 플라스크에 추가합니다.
- 2.5/2.6단계에서 4°C의 2.5/2.6단계에서 사용하지 않은 컨디셔닝 배지 10mL를 15mL 나사 캡 튜브에 보관합니다.
- 1.17/1.18단계를 반복합니다.
3. hNSC 통로
- NSC를 새 플라스크로 확장하는 경우 1.2단계와 같이 모든 새 플라스크가 코팅되었는지 확인합니다.
- 2.1단계와 같이 BSC를 청소하고 1.4단계와 1.5단계를 수행합니다.
- 1.13단계와 같이 매체를 준비합니다. 각 T75 플라스크에는 10mL의 배지가 필요합니다. 여러 T75 플라스크의 경우 10mL의 배지에 플라스크 수를 곱합니다.
- Dulbecco의 인산염 완충 식염수(dPBS) 1 또는 3mL와 포도당을 준비하고 표 2의 부피에 따라 37°C 수조에 넣어 10분(트립신 용액의 경우) 동안 데웁니다. 이때 트립신 또는 DNase를 추가하지 마십시오. DNase는 기계적 또는 화학적 세포 해리로 인해 죽은 세포에서 방출된 DNA를 분해해야 할 수 있습니다.
참고: 9-10일의 성장 후 배양된 하나의 T75 플라스크의 경우 5 × 106이 플라스크에 원래 파종된 경우 약 30 × 106 세포가 있습니다. 일반적으로 10 × 106 세포에는 1mL의 dPBS 용액이 사용됩니다. 따라서 9-10일 후에 배양된 T75 플라스크에는 3mL의 dPBS 용액이 필요합니다.
- 후드에 깨끗한 소형 계량 보트와 혈구계를 놓습니다. 70% 에탄올로 세척하고 후드에서 약 5분 동안 자연 건조합니다.
메모: 계량 보트는 3.17.1단계에서 사용됩니다.
- 인큐베이터에서 배양될 세포의 플라스크를 회수하여 BSC로 가져옵니다. 플라스크를 부드럽게 기울여 세포가 풀링된 배지의 바닥으로 가라앉도록 합니다. 플라스크에는 약 15mL의 매체가 있습니다.
- 5mL 부분(즉, 5mL + 5mL)에서 약 10mL의 매체를 제거합니다. 이 10mL의 배지를 "컨디셔닝 배지"의 경우 "CM"이라고 표시된 깨끗한 15mL 튜브에 넣습니다. 플라스크에 남아 있는 5mL의 배지에 침전된 세포를 흡인하지 않도록 주의하십시오. 이러한 세포와 5mL의 배지는 3.8단계를 따릅니다.
- "CM" 튜브(3.7단계)에서 컨디셔닝된 배지 3mL를 "트립신 억제제 용액"이라고 표시된 15mL 튜브에 넣습니다. 이는 3.12단계에서 사용됩니다. 3mL를 제거한 후 "CM" 튜브에 7mL의 컨디셔닝 배지가 남습니다. 3.9단계까지 "CM" 튜브를 따로 보관하십시오.
- T75 플라스크에 남아 있는 5mL의 배지와 세포를 제거하고 "Cells"라고 표시된 깨끗한 15mL 튜브에 넣습니다.
- 7mL의 컨디셔닝 배지(3.7.1단계)가 들어 있는 "CM" 튜브를 취하고 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 T75 플라스크 바닥을 컨디셔닝된 배지 3.5mL 부분으로 두 번 헹굽니다. 헹굴 때마다 3.5mL 부분을 "세포" 튜브에 넣습니다. 이 단계의 목적은 T75 플라스크에서 모든 신경구(세포)를 제거하는 것입니다.
- "Cells" 튜브를 실온에서 100 x g으로 5분 동안 원심분리합니다. 세포가 회전하는 동안 37°C 수조에서 dPBS/포도당 용액을 얻고 표 2와 같이 적절한 양의 트립신과 DNase를 첨가합니다.
- "Cells" 튜브가 회전을 멈춘 후 컨디셔닝된 모든 배지 상등액을 제거하고 "CM" 튜브로 옮깁니다.
- 3.7.1 단계에서 "트립신 억제제 용액"이라고 표시된 튜브를 가져 와서 표 3에 표시된 트립신 억제제의 부피를 추가합니다. 트립신 용액에 사용된 것과 동일한 부피의 트립신 억제제 용액을 사용하십시오.
- 필요할 때까지 트립신 억제제 용액을 37°C 수조에 넣습니다.
- 15 mL 튜브의 세포 펠릿에 트립신 용액을 추가하고 5 mL 피펫으로 약 5-10회 위아래로 피펫을 만듭니다. 튜브의 캡을 닫고 37°C 수조에서 5분 동안 배양합니다. 5분 후 세포와 피펫을 위아래로 5-10회 회수합니다. 그런 다음 37°C 수조에서 추가로 10-15분 동안 배양합니다.
- 마지막 5분 동안 트립신 억제제 용액을 BSC로 이동합니다.
- 2.14단계가 완료된 후 세포를 회수하고 구가 완전히 해리될 때까지(20-30회) 세포를 위아래로 피펫팅합니다. 그런 다음 즉시 트립신 억제제 용액과 피펫을 위아래로 10회 첨가합니다. 해리된 세포와 트립신 억제제의 이러한 용액은 "세포 현탁액"이라고 합니다.
- 다음 단계에 따라 cell suspension에 있는 세포의 수를 세십시오.
- 15μL의 Trypan Blue 사전 혼합물(5μL의 0.4% Trypan Blue 및 10μL의 dPBS 포함)을 작은 계량 보트에 피펫팅한 다음 5μL의 세포 현탁액을 추가합니다. 피펫을 위아래로 3-5회 혼합합니다. 그런 다음 Trypan Blue/cell 현탁액 10μL를 유리 커버슬립으로 덮인 혈구계의 양쪽에 피펫팅합니다.
- 광학 현미경으로 세포를 관찰하고 4개의 모서리 그리드 각각에 있는 총 세포 수를 계산합니다. 이 숫자들을 더합니다.
- 다른 쪽에 대해서도 계산을 반복하고 두 쪽을 함께 평균화합니다.
- 이 숫자에 10,000을 곱하면 mL당 총 세포 수가 나옵니다. 이 숫자에 총 밀리리터 수를 곱하여 세포 현탁액에 있는 세포의 총 수를 계산합니다. T75 플라스크당 500만 개의 세포를 시드하는 데 필요한 세포 현탁액의 양을 계산합니다.
메모: 일반적으로 9-10일 후에 T75에는 25-30개 × 106개의 셀이 있습니다. 따라서 모든 세포를 새 플라스크에 통과시키는 경우 총 5-6개의 플라스크가 필요합니다.
- 단계 3.19에서 계산한 세포 현탁액의 부피를 각 T75 플라스크에 추가하여 플라스크당 5 × 106 세포를 얻습니다. 부피가 5mL 미만인 경우 조건 배지를 추가하여 총 5mL까지 만듭니다. 그런 다음 성장 인자(표 1)가 포함된 새로운 DFHGFPS 배지 10mL를 플라스크에 추가합니다.
- 1.17 및 1.18단계를 반복하고 플라스크에 세포 유형, 날짜, 플라스크의 세포 수 및 통과 번호(세포가 계대가 계비된 횟수)가 표시되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 4단계로 이동합니다.
- 필요한 경우 플라스크당 최대 30 × 106개 세포의 밀도로 여분의 세포를 하나의 T75 플라스크에 하룻밤 동안 시딩하고 4단계에 따라 다음 날 동결합니다.
4. hNSC 동결 및 저장
- 통과 다음 날, 동결을 위해 세포가 들어 있는 인큐베이터에서 플라스크를 회수합니다(3.19 및 3.22 단계에서). 플라스크를 기울여 플라스크에서 모든 배지와 세포를 제거하고 15mL 튜브에 넣습니다. 그런 다음 216 x g에서 튜브를 5분 동안 원심분리합니다.
- 원심분리 과정에서 동결 매체를 준비합니다(표 4). 5 × 106 세포마다 1mL의 동결 매체를 준비합니다. 세포의 수는 각 플라스크에 얼마나 많은 세포를 넣을 것인지를 결정할 때 3.19단계에서 결정되었습니다. 이 숫자는 하룻밤 사이에 변경되지 않습니다.
- 세포 이름, 통로 번호, 세포 번호, 이니셜 및 날짜가 표시된 라벨이 있는 cryo-preserve 바이알을 준비합니다. 원심분리 후 흡인으로 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 동결 매체에 다시 현탁시켜 5 × 106 cells/mL가 되도록 합니다. 5mL 피펫을 사용하여 바이알당 1mL를 분취하고 단단히 밀봉합니다(바이알당 5 × 106개 셀).
- 바이알을 250mL의 이소프로판올이 들어 있는 극저온 보존 용기에 넣습니다(최대 사용량은 이소프로판올 교체당 5회). -80°C 냉동고에 하룻밤 동안 보관한 다음 액체 질소 탱크 보관 시스템으로 옮깁니다.
5. 검증을 위한 접착 hNSC 도금
- 패시징 전날(3.1-3.22단계), 2.2단계와 같이 BSC를 세척하고 24웰 플레이트와 멸균 유리 12mm 커버슬립을 얻습니다.
- 집게를 사용하여 플레이트의 각 웰 바닥에 단일 커버슬립을 놓습니다.
- 커버슬립이 포함된 웰을 멸균수에 0.01% 폴리-D-라이신(PDL)으로 코팅하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 24웰 플레이트의 경우 웰당 250μL의 PDL을 사용합니다.
- 웰에서 PDL을 제거한 다음 1μg/cm2 laminin/dPBS(웰당 250μL)로 코팅합니다. 플레이트를 37 ° C에서 밤새 배양합니다. 다음날 필요하지 않은 경우 접시 가장자리에 파라필름을 감아 파라필름으로 플레이트를 밀봉하고 4°C에서 보관하십시오.
메모: 라미닌으로 코팅된 플레이트는 커버슬립이 건조되지 않는 한 파라필름으로 밀봉하면 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다.
- 3.1-3.22단계에 설명된 대로 세포를 계대탐색한 다음 코팅된 커버슬립이 있는 24웰 플레이트에 시딩할 세포의 수를 결정합니다.
- 흡인을 통해 웰에서 과도한 라미닌 용액을 제거하고 0.5mL의 dPBS로 한 번 헹굽니다. 그런 다음 세포를 웰당 0.6-1 x 105 cells/cm2의 밀도로 웰에 파종합니다. 3.16-3.21 단계에 따라 나머지 셀을 사용합니다.
- 24웰 플레이트 배양 중 다양한 시간에 다양한 줄기 세포 마커에 대해 세포를 고정하고 염색합니다.