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1. iPSC 응집체 생성
- iPSC 콜로니에서 단일 세포 단층 배양 생성
- 기저막 추출물(BME)로 코팅된 6웰 플레이트를 준비합니다. BME를 4°C의 얼음 위에서 2-3시간 동안 해동하고, 차가운 Dulbecco's Modified Eagle Medium F12(DMEM-F12, 1:50 희석)로 희석하고, 희석된 BME 용액 1mL/웰로 플레이트를 덮고, 플레이트를 4°C에서 밤새 보관합니다.
- 실온(RT)에서 4분 동안 PBS에 0.5mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 포함된 콜로니를 배양하기 전에 인산염 완충 식염수(PBS)에서 0.5mM EDTA가 포함된 6웰 플레이트의 최소 2웰의 배지 및 온전한 iPSC 콜로니를 흡입하고 온전한 iPSC 콜로니를 두 번 세척합니다. EDTA 용액을 흡입하고 5mL의 DMEM-F12 배지로 접시 바닥에서 콜로니를 씻어내어 콜로니를 부드럽게 분리합니다. 15mL 튜브에 모아 원심분리(RT에서 1,200 x g에서 4분)로 펠릿화합니다.
참고: 상업적으로 이용 가능한 섬유아세포에서 재프로그래밍된 iPSC가 성공적으로 사용되었습니다.
- 상층액을 흡입하고 37°C에서 6분 동안 500μL의 세포 해리 시약으로 iPSC 콜로니를 배양합니다.
- 1mL 피펫으로 세포 현탁액을 여러 번 부드럽게 위아래로 피펫하여 나머지 세포 클러스터를 단일 세포로 분해합니다.
- 세포 현탁액에 DMEM-F12 4mL를 첨가하여 세포 해리 시약을 희석합니다.
- RT에서 4분 동안 1,200 x g에서 셀을 스핀다운합니다.
- 5μM Y-27632가 보충된 2mL의 iPSC 배지에 있는 세포를 재현탁하고 종자 세포를 BME로 코팅된 6웰 플레이트의 한 웰에 재현탁합니다.
메모: 단일 세포 단층 iPSC 배양에 대해 재료 표에 명시된 iPSC 배지를 사용합니다.
- 다음 날, 배지를 Y-27632가 없는 새로운 iPSC 배지로 교체합니다. 이 시점부터 iPSC가 100% 융합될 때까지 매일 배지를 교체하여 세포를 계속 배양합니다. 세포주와 시작 웰의 포화도에 따라 2-4일이 소요됩니다.
- 합류하면 iPSC를 통과시킵니다. 배지를 흡인하고 세포에 500μL의 세포 해리 시약을 도포합니다.
- 37°C에서 5-10분 동안 세포를 배양합니다. 플레이트를 부드럽게 흔들어 세포를 분리합니다.
- 2mL의 DMEM-F12를 사용하여 웰에서 세포를 세척하고 15mL 튜브에 수집합니다. DMEM-F12를 추가하여 총 5mL를 만듭니다.
- RT에서 4분 동안 1,200 x g의 세포를 스핀다운하고 상층액을 흡
인합니다.
- 5μM Y-27632가 1:2 - 1:4 비율로 보충된 iPSC 배지에 BME 코팅된 6웰 플레이트(2mL/웰 배지)에 세포를 파종합니다.
- 2-5일 동안 세포를 계속 배양하고 Y-27632가 결핍된 iPSC 배지를 매일 교체합니다. 일단 합류하면 iPSC가 계대(단계 1.1.4-1.1.8).
메모: 세포가 배양 조건에 적응할 수 있도록 iPSC 응집체 생성에 사용하기 전에 재료 표에 명시된 iPSC 배지에서 단층으로 최소 2개의 계대 동안 iPSC를 배양합니다.
- iPSC 응집체 생성을 위해 70-90% 융합된 단층 iPSC 배양물을 사용합니다.
참고: iPSC는 단일 세포가 해리 및 응집 절차 중에 세포 사멸로 이어지는 스트레스에 덜 취약하기 때문에 배양 조건에 적응했습니다. 단층 iPSC 배양은 분화의 증거 없이 전형적인 만능 형태를 나타내야 합니다. 마이코플라스마 오염에 대해 정기적으로 배양물을 테스트하십시오. 마이코플라스마가 없는 iPSC 배양액에서만 작용합니다.
- 6-well 플레이트의 한 well에서 배양 배지를 흡인하고 세포에 500μL의 세포 해리 시약을 도포합니다.
- 37°C에서 5-10분 동안 세포를 배양합니다. 플레이트를 부드럽게 흔들어 세포를 분리합니다.
- 2mL의 DMEM-F12를 사용하여 웰에서 세포를 세척하고 15mL 튜브에 수집합니다. DMEM-F12를 추가하여 총 10mL를 만듭니다.
- 세포 계수를 위해 세포 현탁액에서 25μL를 취하여 25μL의 트리판 블루와 혼합하여 죽은 세포를 표시합니다. 계수 챔버를 사용하여 살아있는 세포를 계수합니다.
- 15mL 튜브의 세포 현탁액에서 충분한 세포(iPSC 응집체당 4,500개 세포)를 수집합니다.
- RT에서 4분 동안 1,200 x g의 세포를 스핀다운하고 상층액을 흡
인합니다.
- 50μM Y-27632가 보충된 적절한 부피의 iPSC 배지에 세포를 재현탁하여 150μL.
당 4,500개의 살아있는 세포를 얻습니다.
메모: 고농도의 Y-27632(50μM)를 사용하는 것은 iPSC의 생존에 매우 중요합니다.
- 부착량이 적은 96웰 U-바닥 플레이트의 각 웰에 150μL를 플레이트화하고 37°C 및 5% CO2.
의 인큐베이터에 넣습니다.
메모: iPSC 응집체를 생성할 때 20일째에 품질 관리를 위해 최소 6개의 오가노이드가 필요하다는 점을 고려하십시오(섹션 5 참조).
2. 전방 신경외배엽 유도
- 4X 또는 10X 파워 렌즈를 사용하여 조직 배양 현미경으로 매일 iPSC 응집체의 형태 변화를 면밀히 모니터링합니다. 1일차에 세포가 명확한 경계로 응집되는 것을 관찰합니다. 인큐베이터에서 37°C 및 5% CO2.
에서 iPSC 응집체를 계속 배양합니다.
메모: 일정량의 죽은 세포/웰은 정상이며 오가노이드 생성에 영향을 미치지 않습니다.
- 2일차부터 시작하여 격일로 바닥에 있는 세포 응집체를 방해하지 않고 배지의 약 2/3를 부드럽게 흡입하여 iPSC 응집체를 공급합니다. Y-27632.
가 결핍된 iPSC 배지 100μL를 추가로 추가합니다.
메모: 4-6일 이내에 세포 응집체의 직경은 350-450μm가 되고 가장자리가 매끄러워집니다.
- 이 단계에서 N2 보충제(1:200), B27 보충제(1:100), 포도당(0.2 mg/mL), 고리형 아데노신 일인산염(cAMP, 0.15 μg/mL), 0.5% 비필수 아미노산(NEAA)이 포함된 DMEM-F12를 포함하는 피질 유도 배지에서 100μL 피펫 팁을 잘라 세포 응집체(최대 20개 응집체/접시)에 풀링합니다. 1% L-알라닐-L-글루타민, 헤파린(10μg/mL) 및 화합물 LDN-193189(180nM), A83-01(500nM) 및 Wnt 반응-1(IWR-1) 억제제(10μg/mL). 세포 응집체를 6cm 접시에 옮긴 후 3일 후에 피질 유도 배지를 변경하여 세포 응집체를 공급합니다.
- 4X 파워 렌즈를 사용하여 조직 배양 현미경에서 피질 유도 중 형태학적 변화를 면밀히 모니터링합니다.
메모: 피질 유도 배지에서 4-5일 후, 세포 응집체의 가장자리가 표면에서 밝아지기 시작하여 신경 외배엽 분화를 나타냅니다. 이 단계에서 가성층화된 상피의 방사상 조직이 나타납니다. 섹션 3으로 진행하여 BME 매트릭스에 셀 응집체를 포함합니다.
3. Matrix Scaffold에 신경외배엽 응집체 포함
- BME를 4°C의 얼음에서 2-3시간 동안 해동합니다.충분한 양의 희석되지 않은 BME를 분취합니다.
- 임베딩 절차를 위한 플라스틱 파라핀 필름 시트를 준비합니다. 멸균 가위를 사용하여 플라스틱 파라핀 필름을 4cm x 4cm의 큰 조각으로 자르고, 100μL 팁을 위한 빈 100μL 팁 트레이 위에 플라스틱 파라핀 필름 조각을 놓고 플라스틱 파라핀 필름 시트에 작은 딤플이 생성되도록 장갑을 낀 손가락으로 누릅니다(1개의 딤플/셀 응집체 필요). 플라스틱 파라핀 필름에 70% 에탄올을 세척하고 밀폐된 멸균 벤치 아래에서 UV 광선(전력: 15와트, 파장: 435nm)을 30분 동안
조사합니다.
- 직경이 1.5-2mm인 100μL 절단 팁을 사용하여 각 셀 응집체를 플라스틱 파라핀 필름 시트의 딤플 하나로 옮깁니다. 두 개의 세포 응집체가 융합된 경우 분리하지 말고 하나의 딤플로 함께 전달하십시오.
- 절단되지 않은 100μL 피펫 팁을 사용하여 세포 응집체를 둘러싼 배지를 부드럽게 흡입합니다.
메모: 세포 응집체를 팁으로 빨아들이면 응집체가 손상될 수 있으므로 주의하십시오.
- 각 세포 응집체에 40μL의 희석되지 않은 BME를 추가합니다.
- 절단되지 않은 100 μL 피펫 팁을 사용하여 BME 드롭의 중간에 각 세포 응집체를 배치합니다.
메모: 피펫 팁으로 발달 중인 신경 상피에 해를 끼치지 않도록 각별히 주의하십시오.
- 멸균 집게를 사용하여 플라스틱 파라핀 필름 시트를 10cm 페트리 접시(또는 다른 충분한 세포 배양 접시)에 조심스럽게 옮기고 접시를 인큐베이터에 15-20분 동안 넣어 BME가 응고되도록 합니다.
- 한편, 5mL의 피질 유도 배지가 들어 있는 부착력이 낮은 6cm 접시를 준비합니다.
- BME의 중합 후, 플라스틱 파라핀 필름 시트에서 세포 응집체를 포함하는 물방울을 제거합니다. 멸균 집게를 사용하여 플라스틱 파라핀 필름을 뒤집고 플라스틱 파라핀 필름 시트에서 물방울이 떨어질 때까지 약간 기울어진(약 30°) 부착력이 낮은 6cm 접시에 세포 응집체를 부드럽게 짜냅니다. 최대 16개의 세포 응집체를 하나의 6cm 접시에 옮깁니다.
- 세포 응집체를 37°C에서 계속 배양합니다.
4. 신경외배엽 응집체로부터 전뇌형 오가노이드 생성
- BME 매트릭스에 삽입한 다음 날, 세포 배양 인큐베이터에 설치된 5° 및 14rpm의 기울임 각도로 흔들리는 세포 배양 쉐이커에 오가노이드 배양 접시를 놓습니다.
- 매일 오가노이드를 모니터링하십시오. 균질한 신경상피 루프와 같은 구조는 BME 매트릭스에 삽입된 후 점차적으로 발달합니다.
- 신경상피루프 구조가 보이면 배지를 N2 보충제(1:200), B27 보충제(1:100), 포도당(0.2mg/mL), cAMP(0.15μg/mL), 0.5% NEAA, 1% L-알라닐-L-글루타민, 인슐린(2.5μg/mL)이 포함된 DMEM-F12를 포함하는 오가노이드 분화 배지로 변경합니다.
- 원하는 분화 시점에 도달할 때까지 3-4일마다 오가노이드 분화 배지를 교체합니다. 그런 다음 오가노이드를 수정합니다(섹션 5 참조).
메모: 때때로, 조직은 루프 구조가없는 광학적으로 반투명 조직의 새싹을 나타낼 수 있습니다. 이것이 이상적이지는 않지만, 피질 구조의 발달에 영향을 미치지는 않는다. 오가노이드는 최대 40일 동안 오가노이드 분화 배지에서 배양할 수 있습니다. 장기간의 배양 기간(40-100일) 동안 오가노이드 분화 배지에 1:50 BME를 보충하여 조직 복잡성을 증가시키고 BDNF 및 GDNF를 추가하여 뉴런의 생존 및 성숙을 허용할 수 있습니다.