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1. iPSC 배양 및 BEC 분화에 필요한 재료 준비.
- IMR90-4 iPSC 배양을 위한 조직 배양(TC) 플라스틱의 매트릭스 코팅
- 부분 표본 기저 멤브레인 매트릭스 겔(예: Matrigel)을 2.5mg 분취액에 넣고 -20°C에서 보관합니다.
메모: 매트릭스 겔과 분취액은 4°C 이상에서 겔을 형성하고 응고된 후에는 분주할 수 없으므로 얼음 위에서 취급할 때는 신속하게 작업하십시오.
- TC 플라스틱 코팅의 경우, 50mL 원뿔형 튜브에 있는 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)/F12 배지 30mL에 매트릭스 겔 분취량 1개를 빠르게 추가합니다. 동결된 매트릭스 겔에 배지 1mL를 추가하고, 해동될 때까지 위아래로 피펫팅하고, 나머지 배지와 함께 50mL 원뿔형 튜브로 즉시 옮깁니다.
- 6웰 플레이트의 웰당 이 매트릭스 겔 코팅 용액 1mL와 T75 플라스크당 12mL를 사용합니다.
메모: 매트릭스 젤 코팅된 TC 플라스틱은 사용하기 최대 2주 전에 준비할 수 있습니다. 그러나 매트릭스 겔 용액이 건조되는 것을 방지하는 것이 중요하며, 이로 인해 웰 위에 때때로 더 많은 DMEM/F12를 추가해야 할 수 있습니다.
- 생물 안전성 작업대의 멸균 환경에서 450mL의 줄기세포 유지 기초 배지에 50mL의 50x 보충제를 첨가하여 줄기세포 유지 배지를 준비합니다.
- 500mL의 무조건 배지(UM)를 준비하려면 392.5mL의 DMEM/F12와 100mL의 녹아웃 혈청 대체체(KOSR), 5mL의 비필수 아미노산, 1mM의 최종 농도의 L-글루타민 및 3.5μL의 β-메르캅토에탄올을 결합합니다. 필터 멸균하고 4°C에서 최대 2주 동안 보관하십시오.
- 200mL의 내피 세포(EC) 배지와 레티노산(RA) 및 bFGF를 준비하려면 198mL의 인간 내피 무혈청 배지(hESFM), 2mL의 필터 멸균 혈소판 부족 유래 혈청(PDS) 및 20ng/mL bFGF를 결합합니다. 필터는 4°C에서 최대 2주 동안 살균 및 보관합니다. 세포를 추가하기 직전에 EC 배지에 10μM의 RA를 추가합니다.
메모: PDS는 중단되어 제한될 수 있으므로 이 프로토콜은 PDS 대신 B27을 사용하여 성공적으로 수행되었습니다.
- RA 또는 bFGF 없이 200mL의 EC 배지를 준비하려면 198mL의 hESFM과 2mL의 필터 멸균 PDS를 결합하고 필터 멸균합니다. 4 °C에서 최대 4 주 동안 보관하십시오.
2. 뇌 내피 세포와 인간 iPSC의 분화
- 분화를 위한 iPSC 도금(분화 프로토콜의 -3일차)
- 분화를 위해 플레이트에 사용되는 IMR90-4 유지 배양 웰에 따라 배양 배지를 흡인하고 웰당 1mL의 효소 세포 해리 시약을 추가하고 37°C에서 7분 동안 배양합니다.
- 세포 1mL당 최소 2mL의 새로운 줄기세포 유지 배지가 있는 15mL 원뿔형 튜브로 해리된 세포 현탁액 1mL를 이동시켜 효소 세포 해리 시약을 비활성화합니다. 5분 동안 1,500 x g에서 셀 현탁액을 스핀다운합니다.
- 사용된 IMR90-4 세포 웰당 1mL의 줄기세포 유지 배지에 세포 펠릿을 재현탁하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.
메모: 계수할 때 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하기 위해 0.4% 트리판 블루로 1:1로 희석하는 것이 도움이 될 수 있습니다. iPSC의 밀도에 따라 6웰 플레이트의 1웰은 일반적으로 1\u20122 x 106 세포를 생성합니다.
- T75 플라스크에서 분화하기 위해 12mL의 줄기세포 유지 배지와 ROCK 억제제(Y27632 디하이드로클로라이드)에 7.5 x 105 세포를 최종 농도 10μM로 첨가합니다. T75 플라스크에서 매트릭스 겔 코팅 용액을 흡인하고 세포 현탁액을 플라스크로 이동합니다. 플라스크를 앞뒤로, 왼쪽에서 오른쪽으로 흔들어 세포를 균등하게 분배하고 37°C 및 5% CO2.
에서 배양합니다.
메모: 이 단계에서 해리된 단일 줄기세포의 생존을 향상시키기 위해 ROCK 억제제를 추가하는 것이 중요합니다. 세포는 플라스크 전체와 ROCK 억제제 처리로 인해 퍼진 중간엽과 같은 형태를 보이는 싱글렛에 고르게 분포되어야 합니다.
- -2일과 -1일째에 배지를 새로운 줄기세포 유지 배지로 변경합니다.T75당 12mL.
- 0일차에는 배지를 UM; T75당 12mL로 변경하여 차별화를 시작합니다.
- UM 일일 변경(1일차 – 5일차).
메모: 세포는 일반적으로 UM에서 2-3일 후에 합류점에 도달하며, 이는 육안 또는 거꾸로 된 명시야 현미경을 통해 관찰할 수 있습니다. 분화가 진행됨에 따라 nestin+ "신경관"이 PECAM-1+ 세포와 함께 보이게 됩니다.
- 20ng/mL bFGF 및 10μM 레티노산(RA)을 갖춘 EC 배지로 전환하고(6일차) 2일 동안 배양하여 내피 세포 집단을 선택적으로 확장합니다. bFGF가 포함된 EC 배지는 최대 2주 전에 준비할 수 있습니다. RA는 사용 당일 냉동 재고에서 추가됩니다(예: EC + bFGF 1mL당 10mM RA 스톡 1μL).
메모: 성공적인 분화는 6일과 8일에 RA를 보충하지 않고도 달성할 수 있습니다. 그러나 RA를 생략하면 TEER이 감소된 BEC가 생성됩니다.
- BEC의 정제 및 실험 수행을 위해 세포 배양 플레이트와 멤브레인 삽입물(예: Transwell)을 콜라겐 IV 및 피브로넥틴(7일차)으로 코팅합니다.
- 멤브레인 인서트 코팅의 경우 콜라겐 IV(0.5mg/mL 아세트산 중 1mg/mL), 피브로넥틴(1mg/mL) 1부, 멸균 조직 등급 물 5부를 결합합니다. ECM 용액은 세포 배양 플레이트를 코팅하기 위해 1:5로 희석할 수 있습니다(즉, 콜라겐 IV 4부, 피브로넥틴 1부, 물 45부). 37 ° C에서 하룻밤 동안 코팅 용액으로 배양하십시오 .
참고: 플레이트와 멤브레인 인서트는 정제 단계의 당일 subculturing 전에 최소 4시간 동안 코팅할 수도 있습니다.
- 콜라겐 IV 및 피브로넥틴 코팅 플레이트 또는 멤브레인 삽입물에서 분화된 세포를 하대배양하여 BEC를 정제합니다(8일차).
- EC 배지를 흡입하고 효소 세포 해리 시약(T75당 12mL)을 추가합니다. 세포의 90%가 플라스크에서 분리될 때까지 37°C에서 배양합니다.
메모: 세포 해리에는 최대 1시간이 걸릴 수 있습니다.
- 배양 시간 동안 이전에 준비된 플레이트/인서트에서 콜라겐 IV/피브로넥틴 코팅 용액을 제거하고 멸균 후드에서 건조시킵니다. 인서트가 건조되는 데 약 20분이 걸립니다.
- 세포가 분리되면 10mL 피펫을 사용하여 플라스크에서 세포를 씻어냅니다. 단일 세포 현탁액을 달성하기 위해 위아래로 피펫팅.
메모: 단일 세포 현탁액은 신뢰할 수 있는 세포 계수와 고체 단층을 달성하는 데 중요합니다.
- 50mL 원뿔형 튜브에 최소한 동일한 부피의 신선한 hESFM으로 희석하고 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
- 1,500 x g에서 10분 동안 셀을 펠렛
화합니다.
- 막 삽입물에 파종을 위해 2 x 106 cells/mL의 현탁액을 달성하기 위해 새로 준비된 EC + bFGF + RA의 적절한 부피로 세포를 재현탁합니다. 12웰 인서트 위에 500μL(1 x 106셀)를 추가하고 하단에 1.5mL의 EC + bFGF + RA 배지를 추가합니다. 24웰 및 48웰 플레이트에서 파스딩하기 위해 세포 현탁액을 1:2로 희석하고 웰당 각각 500μL(5 x 105 세포) 및 250 μL(2.5 x 105 세포)를 추가합니다. 웰 전체에 세포를 고르게 분배하고 삽입하고 37°C에서 5% CO2 이하로 배양합니다.
- 플레이트/트랜스웰의 매체를 bFGF 또는 RA 없이 EC로 교체합니다(9일차).