쥐 대동맥 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 분리

초록

출처: Qi, Y., et al. 대동맥 지방 조직에서 신경 능선 원래 지방 유래 줄기 세포의 격리, 배양 및 지방 유도. J. Vis. 특급 (2020년)

이 비디오는 쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 형광 표지된 신경능선 유래 지방 유래 줄기세포(ADSC)를 분리 및 배양하는 기술을 보여줍니다. 분리 후 NCADSC를 검출하고 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 분류한 후 플레이트에서 배양하여 세포 증식을 촉진합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 기질 혈관 분획(SVF)의 분리

5-6 마우스의 대동맥 주위 지방 조직(PAAT)을 1mL의 갓 준비된 소화 매체가 들어 있는 하나의 2mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 실온(RT)에서 Eppendorf 튜브에 수술용 가위를 사용하여 조직을 다집니다.

1. 혼합물을 9mL의 분해 매체가 들어 있는 50mL 튜브로 옮깁니다. 1 mL 피펫 10x로 위아래로 피펫팅하여 조직을 균질화합니다.
2. 37°C에서 100rpm으로 30-45분 동안 지속적으로 흔들면서 튜브를 배양하고 과소화를 방지하기 위해 5-10분마다 확인합니다. 이는 세포 생존율과 수율을 개선하는 데 중요합니다.
   메모: 조직을 잘 소화하면 튜브를 부드럽게 소용돌이치면 육안으로 볼 수 있는 균일한 연한 노란색 지방 조직이 생성됩니다.
3. RT에서 10% FBS 및 1% v/v PS를 함유한 HDMEM 5mL를 첨가하여 분해를 중지하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다.
4. RT에서 5분 동안 500 x g에서 세포 현탁액을 원심분리합니다. SVF는 갈색을 띤 펠릿으로 볼 수 있습니다. 부유 지방 세포를 조심스럽게 흡인하고 SVF를 방해하지 않고 나머지 상층액을 디캔팅합니다. SVF 펠릿을 10mL의 배양 배지에 용해시키고 70μm 세포 여과기를 통해 여과합니다.
5. 500 x g에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리하고, 상층액을 제거한 후 펠렛을 15mL 원뿔형 튜브의 적혈구 용해 완충액 5mL에 넣고 상온에서 10분 동안 부드럽게 재현탁합니다.
6. 1% FBS를 함유한 1x PBS 10mL를 첨가하여 반응을 중지합니다. 세포 현탁액을 500 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 1% FBS를 함유한 1x PBS 10mL에 펠렛을 재현탁합니다.
7. 세포를 500 x g에서 4°C에서 5분 동안 다시 원심분리합니다.상등액을 제거하고 4°C에서 15mL 원추형 튜브에 5mL의 배양 배지에 펠렛을 재현탁합니다.
8. 최종 원심분리(4°C에서 5분 동안 500 x g) 후 펠릿화된 세포를 얼음 위에서 5mL의 FACS 완충액(10% FBS, 100 units/mL DNA I 및 1% v/v PS 함유 PBS)에 재현탁하고 혈구계로 세포를 계수합니다.

2. FACS에 의한 NCADSC 격리

1. 사용 설명서에 따라 세포 분류기를 설정하고 최적화하십시오. 100μm 노즐을 선택하고, 수집 튜브를 살균하고, 필요한 수집 장치를 설치하고, 사이드 스트림을 설정합니다.
2. RFP+ 세포를 분류하려면 561nm 황색/녹색 레이저 및 광학 필터 579/16을 사용하는 것이 좋습니다. negative control과 single-stained positive control을 사용하여 보정을 수행합니다. 게이팅 체계에 대해서는 그림 1A를 참조하십시오.
3. 40μm 스트레이너를 통해 세포를 여과하고 500 x g에서 5분 동안 원심분리한 다음 0.5–1 x 10⁷/mL의 밀도로 2mL의 FACS 버퍼에 재현탁합니다. 명확하게 라벨링된 5mL 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브로 세포를 옮기고 분류기에 로드합니다.
4. 실험용 샘플 튜브를 4°C에서 실행하고, 편향판을 켠 다음, 1% FBS 및 1% v/v PS.
   이 함유된 RPMI가 사전 코팅된 15mL 원뿔형 튜브로 분류합니다. 메모: RFP 담금질을 최소화하기 위해 강한 빛으로부터 샘플을 보호하십시오.

3. NCADSC의 문화

1. 분류된 세포를 완전한 배양 배지의 12웰 배양 플레이트에 5,000 cells/^cm2 밀도로 플레이트화하고 습한 분위기에서 37°C에서 5%_CO2로 20-24시간 동안 배양합니다.
2. 배양액을 제거하고 예열된(37°C) PBS로 세포를 세척하여 세포 파편을 제거하고 신선한 배양액을 추가합니다.

결과

그림 1: PAAT에서 분리된 NCADSC의 지방생성 분화. (A) NCADSC(RFP) 개체군을 특성화하고 분류하기 위한 일반적인 게이팅 체계. (B) 형광 현미경 이미지는 NCADSC가 12웰 배양 플레이트에서 96시간 파종 후 부착 및 확장되었음을 보여줍니다. (씨-지) 지방생성 유도 후 PAAT에서 오일 레드 O가 NCADSC를 염색했음을 보여주는 대표 이미지. (C) 제어(인덕션 없음). (D) 1차 NCADSC 및 (E) 백색 지방생성 유도 10일 후 3x 통로 NCADSC. (F) 1차 NCADSC...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
증권 시세	VWR 생명과학	0332-100지	50 mg/mL 작업 농도; 로트 #: 0536C008
콜라겐 분해 효소, 유형 I	지브코	17018029
적혈구 용해 완충액	인비트로젠	제00-4333
FBS(증권 시세	코 닝	R35-076-CV	50 mg/mL 작업 농도; 로트 #: R2040212FBS
HBSS (하이브에스)	지브코	14025092
HDMEM	겔라이프사이언스	SH30243.01	로트 #: AD20813268
PBS(인산염 완충 식염수)	ABCONE (중국)	P41970
페니실린-스트렙토마이신	지브코	15140122

표시기 호 표시기 시리즈 년