쥐의 점막하부(submucosa and lamina propria)에서 장 신경교세포(enteric glial cells)를 분리(isorating enteric glial cells from the submucosa and lamina propria of a mouse)

초록

출처: Wang, Z. et al., 성체 쥐의 점막하 및 Lamina propria에서 장 신경교세포의 격리.J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 쥐 장의 점막하 및 판막에서 장 신경교세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 점막하 및 얇은 판 propria 조직을 추출하고, 장 신경교세포를 분리하고, 코팅된 웰 플레이트에서 세포를 배양하여 장 신경교세포 배양을 확립하는 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 멸균 Poly-D-lysine(PDL) 및 Laminin 용액의 준비

1. 세포 분리 최소 하루 전에 폴리-D-라이신(PDL) 및 라미닌 코팅 플레이트를 준비합니다.
   메모: 6웰 플레이트와 12웰 플레이트는 모두 실험 목표에 따라 준비되었습니다. 일반적으로 12웰 플레이트는 웨스턴 블롯을 사용한 정량 분석에 사용된 반면, 6웰 플레이트는 면역조직화학을 위한 오토클레이브(멸균) 커버슬립을 고정하는 데 사용되었습니다. 24웰 플레이트를 사용하여 Ca²⁺ 플럭스 이미징을 위해 장 신경교세포(EGC)를 배양했습니다.
2. HEPA 여과 공기가 있는 조직 배양 후드에서 초순수 조직 배양 등급, DNase-free 및 RNase-free 물로 원액을 희석합니다.
3. 살균 유리 커버 슬립
   1. 멸균 집게로 커버슬립을 잡고 100% 에탄올 비커에 커버슬립을 15분 동안 담그십시오. 조직 배양 후드에서 에탄올이 증발하도록 한 다음 6웰 플레이트에 넣습니다.
   2. 또는 플라스틱 용기에 담긴 2mm 두께의 압지에 여러 개의 커버슬립을 개별적으로 놓은 다음 오토클레이브합니다.

2. 코팅 플레이트

참고: 멸균 조직 배양 층류 후드 아래에서 다음 단계를 수행합니다.

1. 1mg/mL PDL 스톡을 해동하고 멸균 조직 배양 등급의 물로 1:10으로 희석하여 최종 농도가 100μg/mL가 되도록 합니다. 웰당 2mL를 사용하여 6웰 플레이트를 코팅하고, 1mL를 사용하여 12웰 플레이트의 한 웰을 코팅하고, 0.5mL를 사용하여 24웰 플레이트의 한 웰을 코팅합니다. 남은 희석된 PDL을 -20°C에서 12mL 부분 표본에 보관합니다.
2. PDL이 최소 1시간 동안 웰을 코팅하도록 한 후 멸균 피펫으로 PDL을 제거합니다. 플레이트가 조직 배양 층류 후드 아래에서 완전히 자연 건조되도록 합니다.
   메모: 멸균 피펫으로 PDL 용액을 제거한 후 0.22μm 필터를 통과하고 4°C에서 보관한 후 1주일 이내에 2회 더 사용할 수 있습니다.
3. 젤 형성을 피하기 위해 얼음에 라미닌 스톡을 해동합니다.
   메모: 희석되지 않은 라미닌은 8 °C 이상으로 가열하면 고체가 됩니다.
4. 라미닌 스톡(0.5mg/mL)을 멸균 Dulbecco의 DPBS(Phosphate Buffered Saline)로 1:50으로 희석하여 최종 농도 10μg/mL를 얻습니다. 희석된 라미닌을 -20°C에서 12mL 분취액에 보관합니다.
5. 건조된 PDL이 들어 있는 웰에 희석된 라미닌을 추가합니다. 1mL를 사용하여 6웰 표면을 덮고 0.5mL를 사용하여 12웰 플레이트의 바닥을 덮습니다. 커버슬립의 경우, 400μL의 희석된 라미닌을 커버슬립에 추가하여 표면 커버리지를 확보합니다.
6. 코팅된 플레이트를 37°C에서 2시간 동안 배양하며, 플레이트를 같은 날 사용하는 경우(퀵 코팅). 그렇지 않은 경우 플라스틱 랩으로 플레이트를 밀봉하고 4°C(느린 코팅)에서 밤새 보관하십시오.
   메모: 밀봉은 건조 및 오염을 방지하는 데 중요합니다.
7. 표면이 긁히지 않도록 피펫으로 라미닌 용액을 조심스럽게 제거하십시오. 멸균 DPBS로 우물을 세 번 부드럽게 씻으십시오.
8. 각 웰에 완전한 신경교세포 성장 배지를 추가하고 EGC 현탁액을 추가할 준비가 될 때까지 플레이트를 37°C로 유지합니다.
   메모: Poly-D 라이신 및 라미닌 코팅 플레이트는 4 °C에서 3 일 동안 보관할 수 있습니다. 며칠 전에 플레이트를 코팅 한 다음 4 °C에서 보관하십시오. 멸균된 Dulbecco의 DPBS(Phosphate Buffered Saline)로 플레이트를 세 번 세척합니다. 최종 세척 후 각 웰에 2mL의 멸균 DPBS를 추가합니다. 파라필름으로 플레이트를 밀봉하고 4°C에서 보관하십시오. 라미닌이 마르지 않도록 하는 것이 중요합니다.

3. 절연 솔루션 준비

1. EDTA/HEPES/DPBS 해리 솔루션을 준비합니다. 용액 500mL의 경우 멸균 DPBS(칼슘 및 마그네슘 제외)를 사용하여 10mM HEPES 및 5mM EDTA의 최종 용액을 만듭니다. DPBS 490mL에 1M HEPES 완충액 5mL와 0.5M EDTA 원액 5mL를 추가합니다. 사용할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.
2. 표 1에 나열된 시약을 사용하여 신경교세포 재현탁 배지를 준비합니다.
3. 표 2.
   에 나열된 시약을 사용하여 신경교세포 성장 배지를 준비합니다. 메모: GDNF를 함유한 신경교세포(glial) 성장 배지는 4°C에서 1주일 동안 보관할 수 있습니다.

4. 장 분절 제거

참고: 생쥐는 이소플루란 방울 방법으로 안락사되고 중요한 장기를 제거함으로써 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있었습니다. 생후 8주 이상의 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 두 성별 모두 준비에서 눈에 띄는 차이 없이 사용되었습니다.

1. 이소플루란을 과다 투여한 쥐를 안락사시키고 해부 트레이에 누운 자세로 놓습니다. 사지를 고정하고 70% 에탄올로 복부를 살균합니다. 집게로 피부를 덮고 가위로 복부를 엽니다.
2. 간을 들어 올리고 원위 위/유문을 확인합니다. 그런 다음 근위부 장을 7cm 제거합니다. 장이 찢어지지 않도록 주의합시다.
3. 장간막을 잘라내면서 집게로 유문을 잡습니다.
   1. 가위 뒤쪽으로 둔기 절개를 사용하여 부착된 췌장을 긁어냅니다.
   2. 장 분절을 Ca²⁺ 또는 Mg²⁺ 없이 얼음처럼 차가운 DPBS에 놓습니다(그림 1A).
      메모: 장 또는 결장의 다른 부분도 동일한 기술을 사용하여 제거할 수 있습니다.
4. 뭉툭한 끝 부분에 부착된 5mL 또는 10mL 주사기를 사용하여 20G 바늘을 사용하여 얼음처럼 차가운 DPBS로 배설물 내용물을 씻어냅니다(그림 1B).
5. 장을 3cm 분절로 나누어 세로 근육을 제거합니다. 참고: HEPES/EDTA/DPBS 분리 용액 30mL당 최대 2마리 마우스의 장 분절이 사용됩니다.
6. 목화 끝에서 나무 막대기를 분리하기 위해 약 4cm 정도 떨어뜨립니다. 나무 막대기를 DPBS에 담그십시오(그림 1C).
7. 장 분절 중 하나를 젖은 막대기에 부드럽게 밀어 넣습니다(그림 2A-C).
8. 바늘 코 집게를 사용하여 아직 부착되어 있는 부착 장간막을 제거합니다(그림 2D).
9. 깨끗한 면도날이나 메스를 사용하여 장간막이 부착된 장을 따라 두 개의 세로 흠집을 만듭니다(그림 2E).
   1. DPBS로 면 끝을 적십니다. 젖은 면 끝을 근육을 따라 세로로 문질러 종방향 근육/장신경총(LMMP)을 풉니다. 그런 다음 면봉을 수평으로 움직여 LMMP를 제거하는 동안 장 분절의 길이를 따라 원형 근육에서 LMMP를 떼어냅니다.
   2. 엄지와 검지 사이에 스틱 끝을 잡고 중지와 네 번째 손가락으로 세그먼트를 고정합니다(그림 2F). 완료되면 LMMP는 장 분절을 쉽게 벗겨냅니다.
10. myenteric plexus에서 EGC를 채취하려는 경우가 아니면 장관에서 벗겨내어 면봉에 부착된 LMMP를 폐기합니다.
11. 면도날을 사용하여 장 부분을 세로로 열어 나무 막대기에서 제거합니다.
12. 벗겨낸 장 조직(주로 점막과 점막하 및 원형 근육)을 얼음 위의 DPBS에 보관하십시오. 모든 장 분절이 준비될 때까지 4.4–4.11단계를 반복합니다.

5. 상피 점막 제거

1. 가위로 장을 ~0.5cm의 더 작은 조각으로 자릅니다.
2. 30mL의 얼음처럼 차가운 EDTA/HEPES/DPBS 용액이 들어 있는 멸균 50mL 원뿔형 원심분리기 튜브에 조직을 넣습니다.
3. 조직 함유 용액을 4°C에서 분당 ~60틸트로 10분 동안 흔듭니다.
4. EDTA/HEPES/DPBS 버퍼를 위아래로 한 번 피펫팅하여 5mL 플라스틱 피펫을 미리 적신 다음 미리 적신 피펫을 사용하여 조직과 완충액 현탁액을 위아래로 20회 피펫팅(분쇄)하여 상피 점막을 제거합니다.
5. 100μm 나일론 세포 여과기를 통해 혼합물을 부어 EDTA 배양에서 조직을 수집합니다. 탁한 점액으로 채워진 관류는 폐기합니다(그림 3).
6. 스트레이너에 남아 있는 조직을 니들 노즈 집게를 사용하여 30mL의 얼음처럼 차가운 EDTA/HEPES/DPBS가 들어 있는 새로운 50mL 원뿔형 원심분리 튜브에 넣습니다.
7. 추가 상피 점막을 제거하기 위해 분당 ~60 틸트에서 10분 동안 4°C에서 조직을 흔들어 EDTA/HEPES/DPBS 배양을 두 번째로 반복합니다.
8. 5mL 피펫에 완충액을 미리 적신 다음 조직 현탁액을 위아래로 20회 피펫팅하여 점액 세포를 제거합니다.
   메모: 조직은 상피가 더 많이 제거됨에 따라 피펫 내부에 달라붙는 경향이 있습니다.
9. 두 번째 배양 후 100μm 나일론 세포 여과기에 혼합물을 붓고 흐름을 버리하여 조직을 수집합니다. 두 번째 플로우 스루는 첫 번째 플로우 스루보다 눈에 띄게 덜 탁해야 합니다(그림 3).
10. 용액이 거의 투명해질 때까지 10분 EDTA 배양을 반복합니다(조직의 양과 분쇄의 효과에 따라 약 3-4회의 배양)합니다(그림 3).

6. Lamina Propria 및 Submucosa에서 장 신경교세포 수집

1. 나일론 스트레이너의 조직을 5mL의 시판되는 세포 회수 용액과 암석이 들어 있는 15mL 원뿔형 원심분리 튜브로 4°C에서 25-30분 동안 옮깁니다.
2. 장 신경교세포(enteric glial cell)를 얇은 판막(lamina propria)에서 분리하기 위해 부드럽게 10배 분쇄합니다.
   1. 40μm 필터를 통해 여과하고 깨끗한 50mL 튜브에 여과액을 수집합니다.
   2. 나일론 필터의 조직을 DPBS 1mL로 헹굽니다.
   3. 조직을 버리고 ~5–6mL의 여과액을 깨끗한 15mL 원추형 원심분리 튜브에 옮깁니다.
   4. 스윙 버킷 원심 분리기에서 2,000 x g의 여과액을 4°C에서 5분 동안 회전시킵니다.
3. 500μL 피펫 팁으로 펠릿을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 최소 1mL의 재현탁액에 신경교세포 함유 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 거품을 도입하지 마십시오.
   메모: wells와 plates의 수에 따라 필요에 따라 resuspension volume을 조정합니다. 예를 들어, 6웰 플레이트 1개의 경우 1.2mL, 6웰 플레이트 2개의 경우 2.4mL, 12웰 플레이트 1개의 경우 2.4mL입니다.
4. 200 μL의 세포 현탁액을 6-well 또는 100 μL의 각 well에 피펫으로 주입하여 glial 성장 매체를 포함하는 12-well PDL-laminin 코팅 플레이트에 주입합니다.
5. 플레이트에 세포를 추가하고 37°C 인큐베이터에 넣은 후 접시를 방해하지 마십시오.
   메모: 건강한 세포 제제는 6-8시간 이내에 부착되지만, 비부착성 세포와 함께 배지를 부드럽게 피펫으로 분리하여 배지를 교체하기 전에 최소 24시간 동안 기다립니다.
6. 배양에 들어간 후 3-4일 후에 세포를 실험에 사용합니다(그림 4).

표 1. 신경교세포 재현탁 매체의 구성.

구성 요소	추가할 볼륨	최종 집중
DMEM/F12	44.5 밀리리터	_
소 태아 세럼(FBS)	5 밀리리터	10%
페니실린-스트렙토마이신	500 마이크로L	100 IU/mL 펜
스트렙토마이신		100 μg/mL 연쇄상구균
겐타마이신(50mg/mL 재고)	20 마이크로L	20 μg/mL

표 2. 신경교세포 성장 배지의 구성

구성 요소	추가할 볼륨	최종 집중
DMEM/F12	44 밀리리터	_
소 태아 세럼(FBS)	5 밀리리터	10%
페니실린-스트렙토마이신(100x)	500μL	100 IU/mL (펜)
100 μg/mL (연쇄상구균)
겐타마이신(50mg/mL 재고)	20 마이크로L	20 μg/mL
GDNF(10μg/mL 재고)	50 마이크로L	10 ng / mL

결과

그림 1: 마우스 장의 설정 및 준비.(A) 추출된 장을 포함하여 얼음 위에 설치된 격리 사진. (B) 배설물 내용물을 씻어내기 위해 20G의 뭉툭한 끝 바늘에 부착된 5mL 주사기의 사진. (C) DPBS 완충액에 담근 나무 면봉(~4cm)의 엔지니어링 끝.

그림 2: 장을 청소하고 종근/장신경총(LMMP)을 제거하는 데 사용되는 단계.(A-C

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Poly-D 라이신(1mg/ml 스톡)	시그마	A-003-E	1:10을 희석하십시오
라미닌 (0.5 mg / ml 재고)	시그마	엘4544	ICE에서 10 μg/mL로 희석
EDTA (0.5미디엄)	론자	51201	DPBS로 1:100 희석
헤페스 (1M)	코 닝	36216004	DPBS로 1:100 희석
세포 회수 솔루션	코 닝	354253
Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)	하이클론	SH30028.02
DMEM/F-12	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	11320033
페니실린-스트렙토마이신(100X)	생명 기술	15140-122
겐타마이신(50mg/mL 재고)	생명 기술	15750060
GDNF (10 μg 재고)	시그마	SRP3200
L-글루타민(200mM 재고)	생명 기술	제25030-081
나일론 메쉬 셀 스트레이너 (100 μm)	피셔 사이언티픽	22363549
나일론 메쉬 셀 스트레이너 (40 μm)	피셔 사이언티픽	22363547
일회용 Serologic Pipet 5 ml	피셔 사이언티픽	13-678-11일
0.25% 트립신-EDTA (1X)	생명 기술	제25200-056

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