돼지 뇌에서 모세혈관 정화

초록

출처: Nielsen, S. S. E., et al. 돼지 뇌 내피 세포를 기반으로 한 체외 혈액 뇌 장벽 모델 구축을 위한 개선된 방법. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 신선한 돼지 뇌에서 모세혈관을 분리하는 방법을 보여줍니다. 이 과정에는 수막을 제거하고, 뇌 조직에서 회백질을 분리하고, 모세혈관을 분리하기 위해 회백질을 균질화 및 여과하고, 마지막으로 효소 소화를 사용하여 모세혈관을 추가로 정화하는 작업이 포함됩니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 돼지 뇌 모세 혈관

정화

1. 5-6개월 된 사육돼지(예: 인근 도축장)에서 8-10개의 뇌를 채취하여 얼음에 담아 실험실로 운반합니다. 동물을 살해한 후 2-3시간 이내에 다음 정화 절차를 시작하는 것이 좋습니다.
2. 뇌를 멸균 플로우 벤치에 놓고 얼음 위에 놓인 비커에 1L PBS로 부드럽게 씻습니다.
3. 가는 팁 집게를 사용하여 한 번에 한 뇌에서 수막을 조심스럽게 제거하고 수막이 없는 뇌를 얼음 위에 PBS를 놓은 다른 1L 비커로 옮깁니다. 소요 시간을 늘리면 제거가 복잡해질 수 있습니다. 각 뇌에 사용되는 대략적인 시간은 10-15분이어야 합니다.
4. 메스를 사용하여 한 번에 하나의 뇌에서 회백질을 긁어내고 분리된 물질을 얼음 위에 놓인 20mL DMEM 영양 혼합물 F-12(DMEM/F-12)가 들어 있는 페트리 접시(8.8cm²)로 옮깁니다. 백질 물질을 빼내지 않고 가능한 한 많은 회백질을 분리하십시오. 초기 단편화를 위해 바늘 없이 50mL 주사기를 통해 회백질 물질을 실행합니다. 모든 뇌에 대해 계속하고 수집된 회백질 물질을 모읍니다. 소요 시간을 늘리면 제거가 복잡해질 수 있습니다. 각 뇌에 사용되는 대략적인 시간은 10-15분이어야 합니다.
5. 분리된 회백질 물질을 DMEM/F-12 매체를 사용하여 50/50의 비율로 휴대용 조직 균질기의 분쇄기 튜브로 옮깁니다. 느슨한 절굿공이로 8번의 위아래 스트로크를 한 다음 단단한 절굿공이로 8번의 위아래 스트로크를 만들어 재료를 균질화합니다. 분리된 모든 물질이 균질화될 때까지 계속한 다음 균질액을 500mL 병으로 옮기고 DMEM/F-12로 약 450mL의 총 부피로 희석합니다.
6. 필터 홀더와 140μm 필터 메쉬가 있는 500mL 파란색 뚜껑 병을 사용하여 균질액을 여과하고 필터를 통해 조직을 통과시켜 모세혈관을 분리합니다. 호모게네이트 50mL당 하나의 필터를 사용하고 나중에 각 필터를 DMEM/F-12로 세척합니다.
7. 모세관 함유 필터를 트립신/EDTA(PBS에서 2.5% 트립신, 0.1nM EDTA), 콜라겐분해효소 CLS2(2,000 U/mL) 및 DMEM/F-12에서 DNase 1(3,400 U/mL)의 분해 용액과 함께 페트리 접시에 넣습니다. 필터 메쉬 1개당 페트리 접시 8.8개(^{2cm, 20mL} 용액) 3개를 사용합니다.
8. 페트리 접시를 37°C에서 180rpm의 오비탈 셰이커에 1시간 동안 놓거나 10분마다 부드럽게 저어줍니다. 1시간 후 1mL 피펫을 사용하여 페트리 접시의 현탁액으로 필터의 모세혈관을 씻어냅니다.
9. 3개의 접시에서 현탁액을 2개의 50-mL 튜브로 분리하고 각 50-mL 튜브에 10mL DMEM/F-12를 추가하여 분해를 중지합니다.
10. 세포 현탁액을 250 x g, 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상등액을 흡입하고 각 펠릿을 10mL의 DMEM/F-12에 다시 현탁시킵니다. 각 튜브에 DMEM/F12 20mL를 더 추가합니다. 이 원심분리기 단계를 두 번 반복합니다.
11. 튜브를 얼음 위에서 5분 동안 식힌 후 용액을 새 50mL 튜브 2개에 옮깁니다.
12. 세포 현탁액을 250 x g, 4 °C에서 5분 동안 원심분리하고 FBS에서 10% DMSO로 구성된 8 - 10 mL(약 1 mL/뇌 사용)의 동결 용액에 각 펠릿을 다시 현탁시킵니다.
13. cryovial당 1mL를 사용하여 세포 현탁액을 cryovials로 옮깁니다. 평균적으로 정제는 사용된 뇌당 1개의 바이알을 생성하며, 평균적으로 12-16개의 삽입을 위한 내피 세포를 제공합니다. 바이알을 -80°C의 냉동 상자에 최소 4시간에서 하룻밤 동안 놓습니다. 그 후, cryovials를 액체 질소가 함유된 cryotank에 보관하십시오.
    주의: 액체 질소는 온도가 매우 낮습니다. 적절한 보호구를 착용하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM/F-12	론자	BE12-719F
소 태아 혈청(FBS)	Gibco Invitrogen	10-270-106
트립신/EDTA	Gibco Invitrogen	제15090-046
디엠소	시그마-알드리치	34896
PBS (PBS)	시그마-알드리치	D8537
DNA제 1	시그마-알드리치	D4513
콜라겐 분해 효소 CLS2	시그마-알드리치	C6885
DDH2O			엘가 시스템으로 제작
15ml 원심분리기 튜브	(주)셀스타	188271
50ml 원심분리기 튜브	(주)셀스타	227261
페트리 접시	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	150350
크라이오 바이알	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	377224
500ml 병	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	159910/159920
메스	스완-모르텐	REF0211	유형 24
조직 균질화기	시그마	D9188
140μm 필터	머 크	NY4H04700
가는 팁 곡선형 집게	KLS 마틴	Tel.: 12-409-12-07
넓은 팁 겸자	폭스바겐	82027-390
필터 홀더	MERCK 밀리포어	스위넥스-47
주사기 50ml	브라운	4617509F

호 ) 년 ) ) 호 년